生物制药考试重点(2)

17、克隆 P284指生物体通过体细胞进行的无性繁殖，以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群。通常是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因的个体或种群。

18、质粒 : 质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。大部分的质粒虽然都是环状构形，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的线粒体等胞器中。

19、载体： (定义：指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。）

主要有质粒载体和噬菌体载体。几乎所有cDNA的克隆都采用质粒载体进行。目前广泛采用的质粒载体多数都是由pBR322质粒发展而来。

pBR322质粒载体的优点：1具有较小的分子量(﹤5kb)。2具有两种抗生素抗性基因，可用作转化子的选择记号，对24种限制性内切酶有单一的识别位点。3具有较高的拷贝数（一般为15个拷贝，加氯霉素后，细胞中可累积1000-3000个质粒拷贝）。

噬菌体载体是在λ噬菌体的基础上构建的克隆载体。

20、cDNA文库：在细菌中增殖来自某一生物染色体基因组DNA或来自某一组织所有不同的m-RNA的每一种cDNA分子，所形成的全部DNA片段克隆的集合体。（以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段

表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。）

21、PCR：是指由一对引物介导的基因或克隆的特定DNA序列的酶促扩增的反应过程，即在一对人工合成的特异性引物介导下，以目的DNA为模板，使用耐热DNA聚合酶，经变性、退火及延伸三个步骤的多次循环，扩增特定DNA片段的过程（其本质是DNA复制）

（或PCR即多聚酶链式反应。是DNA的一种体外扩增技术。用于放大扩增特定的DNA片段。具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。） 22、叙述反转录法（酶促合成法）制取目的基因的主要过程。

进一步的验证和鉴定

23、在大肠杆菌表达目的基因，对载体有哪些要求？P22

表达载体必须具备下列条件：（1）有位于启动子序列后的灵活的克隆位点和方便的筛选标记，克隆位点位于启动子序列后；（2）有很强的启动子能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别，如lac,trp或tac启动子及Ｔ7,SP6噬菌体启动子等；（3）有阻遏子，使启动子受控，可以人为选择启动子起始转录m-RNA的时机；（4）有很强的终止子，产生m-RNA较稳定；（5）具有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列（6）能独立地复制；

24、有哪些因素影响目的基因在大肠杆菌中的表达？

1）外源基因的数量：高拷贝的表达质粒会导致外源基因拷贝数的增加，对提高外源基因的总体表达水平非常有利。2）外源基因的表达效率：启动子的强弱 ，必须把真核基因编码区置于大肠杆菌RNA聚合酶能识别的强启动子控制下；核糖体结合位点的有效性 ，消除在结合位点及其附近的潜在二级结构；SD序列和ATG之间的距离是表达非融合蛋白的关键；密码子的组成，应选择使用大肠杆菌偏爱的密码子。3）表达产物的稳定性：组建融合基因产生融合蛋白；利用大肠杆菌的信号肽或某些真核多肽中自身的信号肽，把真核基因产物搬动到胞浆周质的空隙中。不易被细菌酶类所降解；采用位点特异性突变的方法，改变真核蛋白质中二硫键的位置，从而增加蛋白质的稳定性；选用蛋白酶缺陷型菌株，减少表达产物的降解；4）细胞的代谢负荷；5）工程菌的培养条件 25、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析的工作原理和基本操作？

1） 离子交换层析的基本原理P51(课本为准）：（PPT上的：以离子交换剂为固定

相，依据流动相中组分离子与交换剂上平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。）（课本上的：当溶液中存在着A、B两种或两种以上的离子，并通过离子交换层析柱时，原来吸附在离子交换介质上的离子与溶液中高浓度的A、B离子发生交换作用，脱离离子交换介质，游离在流动相中，并随流动相流出来。由于A、B两种离子在同一溶液中的解离度不同，它们所带的净电荷有差异，因此两者在层析柱内的迁移速度不同。从上样起始点至A、B两离子的层析峰间的距离在加大，最终完全分离。基本操作：（1）离子交换剂的选择：阴阳离子交换剂的选择、 强弱离子交换剂的选择、 不同离子型交换剂的选择、 不同基质离子交换剂的选择(2)离子交换剂的预处理、再生和保存(3)层析柱(4)平衡缓冲液的选择(5)上样(6)洗脱(7)样品的浓缩与脱盐）

亲和层析的基本原理P56

利用固定化配体与目的蛋白质之间非常特异的生物亲和力进行吸附，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。 亲和层析的基本操作P58

（1）上样，选择适当的条件，包括上样流速、缓冲液种类、pH、离子强度及温度等，以使待分离物质能够充分结合在亲和吸附剂上。

（2）洗脱，选用某种能削弱专一性吸附作用的条件（包括：pH值、温度、离子强度、替代物。适量的氢键破坏剂如脲、盐酸胍等），将目的物洗脱下来。洗脱方法可分为：特异性洗脱和非特异性洗脱。特异性洗脱（亲和洗脱），利用洗脱液中的物质与待分离物质或与配体的特异亲和性而将待分离物质从亲和吸附剂上洗脱下来。非特异性洗脱，通过改变洗脱液pH值、温度、离子强度等条件，降低待分离物质与配体的亲和力而将待分离物质洗脱下来。

（3）亲和吸附剂的再生和保存， 一般可用大量洗脱液或较高浓度的盐溶液洗涤，再用平衡液重新平衡。 凝胶过滤层析的基本原理P59

以多孔的凝胶填料为固定相，按分子大小对溶液中各组分进行分离的液相层析方法。

凝胶层析的基本操作

（1）凝胶的选择（2）凝胶的处理和保存（3）层析柱的选择 （4）加样（5）洗脱速度

26、对由基因重组技术所获得的蛋白质药物产品进行鉴定时常做哪些项目分析？

物理性状、鉴别试验、水分测定、无菌试验、热原试验、干扰素效价测定、安全试验。

27、细胞株: 原代培养的细胞一般传至10代左右就不容易传下去了，细胞的生长就会出现停滞，大部分细胞衰老死亡。但是有极少数的细胞能够度过“危机”而继续传下去，这些存活的细胞一般能够传到40--50代，这种传代细胞叫做细胞株。

（通过选择法或克隆形成法，从原代培养物或细胞系中获得的稳定的具有特殊性质或标志的培养物。细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。） 28、细胞库 P91 29、批

30、有效期：标识于原料药的包装或标签上，表明在规定的储存条件下，在该日期内，原料药的标准应符合规定的要求，并且超过这个日期就不能再使用” 31、失效期：原料药包装容器/标签上注明的日期，表示原料药在规定条件下贮存时预计可保存的时间，超过这一期限原料药不应当被使用。 32、生产用动物细胞有哪些种类？它们各具有什么特点？P86

（1）生产用的动物细胞的种类：原代细胞系、二倍体细胞系、转化细胞系、融合细胞系、重组工程细胞系 （2）它们各自的特点： …… 此处隐藏：1760字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……