环孢素A丙烯酸树脂L100纳米粒的研究 - 图文(3)

苏州大学硕士学位论文 前言

前言

环孢素A（Cyclosporine，CyA）是Tolypocladium真菌的一种代谢产物，是一种由十一个氨基酸组成的环状多肽，能特异而可逆地作用于淋巴细胞，而不影响造血及吞噬细胞的功能，是一种强效的免疫抑制剂，现已被广泛应用于肝、肾、肺、骨髓、胰等器官移植病人抗排斥反应以及自身免疫疾病如银屑病、类风湿关节炎等疾病的治疗。环孢素A具有较大分子量（1202.6），强亲脂性（lgP=2.92）和低水溶性（37℃，1.73μg/ml）,且高度依赖胆汁吸收，并具有广泛的胃肠道代谢作用， 因而口服吸收差，生物利用度低，个体差异大，限制了其在临床上的广泛应用[1-3]。而市售制剂新山地明（Neoral）口服遇胃肠液后能够自动乳化成30nm左右的微乳，改善了CyA口服生物利用度低，药动学变异性大的缺点。但是自微乳中含有的增溶剂Cremophor? EL能引起严重的肾脏毒性和过敏反应。

为解决上述存在问题，国内外应用药物制剂新技术将环孢素A制成微乳(microemulsions)，纳米粒(nanoparticles)，脂质体(liposomes)等。其中纳米粒具备了其他输送体系所无法比拟的优点，如靶向性给药，改变药物体内分布，调节释药速度，改善药物口服吸收，提高生物利用度，降低药物毒副作用等。由于其独特的药物保护作用及控制释放特性，可作为难溶性药物以及蛋白质多肽基因等不稳定药物的有效载体，具有极高的研究价值和开发潜力。

本课题以高分子聚合材料丙烯酸树脂Eudragit L100作为载体材料，以泊洛沙姆P188为乳化剂，采用乳化溶剂扩散法制备了CyA纳米粒(CyA-L100-NP)。以粒径大小、分布、回收率、包封率及载药量为指标，均匀试验法筛选最佳制备工艺，并对纳米粒表面形态及物理特征进行研究。此外，初步研究了纳米粒的稳定性和冻干工艺以及体外释药特性。以市售制剂Neoral为对照，通过小鼠口服给药研究药物体内药动学及组织分布，评价纳米粒能否提高CyA相对生物利用度以及是否具有靶向性，为制剂的进一步开发应用打下理论基础。

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苏州大学硕士学位论文 第一章 环孢素A纳米粒的制备工艺

第一章 环孢素A纳米粒的制备工艺

纳米粒是当前药剂学研究的新型亚微粒给药系统，具有靶向性给药，改变药物体内分布，调节释药速度，改善药物口服吸收，提高生物利用度，降低药物毒副作用等优点，已成为国内外药剂学研究的热点领域。纳米粒的制备方法通常有乳化-溶剂蒸发法、乳化-溶剂扩散法、聚合法、薄膜-超声法、高压乳匀法等等[4]，可根据药物性质选择不同的制备方法，通常采用药物粒径大小、包封率、回收率、载药量等指标来对纳米粒的制备工艺进行评价。本文根据实验室条件并参考相关文献[5]，采用改良的乳化溶剂扩散法来制备载药纳米粒，考察了泊洛沙姆P188量、载体材料量、温度、搅拌时间、油水比例等因素对纳米粒制备的影响，以粒径、回收率、包封率、载药量等作为综合指标，通过均匀设计法优化纳米粒制备工艺，确定了最佳处方。

§1.1 实验材料 1.试剂及药品

环孢素A（福建科瑞药业有限公司，批号 060801 ，纯度99.3%）；Eudragit L100(德国R?hm 公司)；泊洛沙姆188 (Poloxamer 188，P188，沈阳药大集琦药业有限责任公司)；无水乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙腈及甲醇均为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司）；水系蒸馏水 2.主要仪器

DF-101S集热式恒温磁力搅拌器（巩义市英屿华中仪器厂）；W370-1红外快速干燥箱（巩义市英屿华中仪器厂）；KQ-100DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；LG-5真空冷冻干燥机（上海市离心机械研究所）；PB203-N电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；Optima Max 超速冷冻离心机(贝克曼库尔特有限公司)；Zetasizer HPPS激光粒度分布仪（英国马尔文仪器有限公司）；H600型透射电镜（日立公司）； LC-10A高效液相色谱(日本岛津)

医学统计学程序（PEMS）程序：由四川大学医学院统计学教研室编制

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§1.2 方法与结果

一、环孢素A体外含量测定方法的建立 1. 色谱条件

参照有关文献的HPLC法[5-17]，改进后用于本实验中CyA的含量测定。 色谱柱：phenomenex (luna 5μ C18 (2)，100R,250×4.6mm，5 micron，广州菲罗门公司)

流动相：乙腈:甲醇:水=80:10:10(v:v:v) 流速：1.0 mL/min 柱温：70 ℃ 检测波长：210nm 进样量：20μL 2. 线性关系的考察 2.1 标准母液的配制

精密称取环孢素A原料药10.27mg于100mL容量瓶中，用甲醇定容，配成102.7μg/mL的标准母液备用，-4℃冰箱储存。 2.2 标准曲线的绘制

精密吸取CyA标准母液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL、8.0mL于10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成不同浓度的系列标准液，取20μL进样，记录药物峰面积，数据见表1-1。

表1-1 CyA的浓度及峰面积

Tab 1-1 The calibration of CyA (μg/mL)

Conc 1.027 2.054 4.108 8.216 10.270 20.540 30.810 41.080 51.350 61.620 102.700 A 31360 64985 131689 255759 325821 660962 1035566 1326230 1680831 2042330 3486188

以峰面积（y）对浓度（x）作回归，得到线性方程为：y =33765x－20740，r=0.9997。线性范围：1.027~102.7μg/mL，标准曲线图见图1-1。

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4000000350000030000002500000200000015000001000000500000002040Conc6080100A

图1-1 CyA标准曲线 Fig 1-1 Standard Curve of CyA

3. 回收率实验

取空白纳米粒适量于10mL容量瓶中，按照标准曲线项操作配制4.108、20.54、51.35μg/mL低、中、高三种浓度的溶液，进样20μL，测定回收率，结果见表1-2。

表1-2 CyA 回收率结果(n=3)

Tab 1-2 The result of the recovery of CyA (n=3) Conc. added (μg/mL)

4.108 20.54 51.35

Conc. determined (μg/mL) 4.514±0.009 20.190±0.279 50.395±0.404

Mean recovery (%) 109.893 98.294 98.139

RSD (%) 0.206 1.382 0.801

4. 精密度实验

取空白纳米粒适量于10mL容量瓶中，按标准曲线项制备4.108、20.54、51.35μg/mL三种浓度的溶液，于一天内连续进样3次，计算日内精密度（n=3），并且连续三天进样(n=3)，计算日间精密度，数据见表1-3。

表1-3 方法精密度(n=3)

Tab 1-3 Precision of the method (n=3) Conc (μg/mL) 4.108 20.54 51.35

Within-run Conc(μg/mL)±SD 4.619±0.026 20.460±0.257 51.102±0.322

RSD (%) 0.559

1.258 0.631

4

Between-run Conc(μg/mL)±SD 4.876±0.081 21.116±0.181 52.227±0.736

RSD (%) 1.651

0.856 1.410

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