医学分子生物学复习思考题及答案(5)

③ 用于真核细胞阳性克隆筛选的筛选标志，常是药物抗性基因，如TryⅠ基

因等。

真核表达载体根据宿主细胞不同，又分为：酵母表达载体、昆虫表达载体、哺乳动物细胞表达载体等。

8、重组DNA技术包括哪些基本过程？如何获得目的基因？

答：一个完整的重组DNA过程包括五大步骤，简称为：

分、选、接、转、筛

（一）目的基因的分离获得—分

１、人工化学合成法：用DNA自动合成仪合成，主要用于小片段DNA合成，若基因片段太长，先分段合成后再连接成长片段基因。

2、从基因文库中获得：从基因组文库及cDNA文库中，采用核酸杂交等方法获取目的基因。

3、PCR法：是目前最常用的方法，根据目的基因两端的碱基顺序合成一对引物，经PCR扩增获得目的基因。

4、其它方法：如酵母杂交法系统克隆得与蛋白质特异相互作用的基因等。

9、如何选择基因载体？

答：载体的选择与构建—选

DNA克隆目的主要有二个：

① 获得目的DNA片段的大量拷贝

② 获得目的DNA片段的表达产物蛋白质。

针对目的①应选用克隆载体。针对目的②

应选用表达载体

此外，还要根据目的DNA片段大小，受体细胞的种类、来源等对载体进行选择。有的克隆过程要求载体上有多克隆位点（MCS）

10、目的DNA与基因载体的连接方法有哪些？试述之

答：1、粘端连接法（粘性末端链接法）

（1）单一相同粘端链接法：用同一种限制性核酸内切酶（RE）切割目的DNA及载体DNA，产生完全相同的单链互补粘性末端，然后由连接酶催化将目的DNA与载体DNA连接起来。

（2）不同粘端连接法：用两种不同的RE酶切目的DNA及载体DNA。结果，目的DNA及载体DNA的两端就可产生两个不同的粘端，于是目的DNA就能定向的插入载体中。这种使目的DNA按特定方向插入载体的克隆方法。称之为定向克隆（directed cloning）.

（3）其它粘端连接法

① 人工接头法：人工合成含有某种RE酶切位点的双链寡核苷酸称之为接头（adaptor），然后将此接头与目的DNA连接起来。用同一种RE酶切带接头的目的DNA及载体DNA，产生单一相同粘端，再由连接酶催化将二者连接。

②同聚物尾法：在末端转移酶催化下，将一种核苷酸（如dc）逐一连接在目的DNA的3’端，形成同聚物尾。用同样方法将另一互补核苷酸（如dG）逐一连接在载体DNA的3’端，形成互补的同聚物尾，于是粘端连接法将二者连接起来。 ③ PCR法：针对目的DNA两端设计合成一对特异性引物，在每条引物的5’端分别连接上不同的RE的酶切位点。当用这种引物以目的DNA为模板进行PCR扩增时，得到的扩增物目的DNA的两端就分别含有不同RE的酶切位点。用这两种不同的RE酶切目的DNA及载体DNA，于是，目的DNA就能定向插入到载体DNA中。

2、平端连接法

目的DNA及载体DNA两端均为平端时，由DNA连接酶催化将二者连接起来

3、粘—平末端连接法

目的DNA两端与载体DNA两端连接时，其中的一端为粘端连接，另一端为平端连接，称粘—平末端连接法。

11、什么是感受态态细胞？重组DNA转入宿主细胞的方法有哪些？

答：感受态细胞：用化学物理方法处理宿主细胞，使之成为接受外源DNA的最佳状态，称之为感受态细胞。

重组DNA转入宿主细胞的方法有：

1、转化：重组质粒转入大肠杆菌称转化。重组质粒直接导入酵母细胞也称转化。使用方法有氯化钙化学诱导法，电穿孔法等。

2、转染：外源DNA直接导入真核细胞（酵母细胞除外）的过程称转染。使用方法有磷酸钙共沉淀法、脂质体融合法、显微注射法、电穿孔法等。

3、感染：以噬菌体或病毒为载体构建重组DNA，再包装成病毒颗粒，通过感染的方式将重组DNA转入细菌体内或哺乳动物细胞。

12、借助载体上遗传标志进行筛选阳性重组细胞的方法有哪些？试述之？

答：（1）利用抗生素抗性标志筛选：如用质粒作为载体构建重组体，质粒上有AmpR（抗氨苄青霉素基因），当这种重组DNA（体）导入细胞后，这种细胞对Amp 就有抵抗性，在含有Amp 的培养基上就能生长。而导入不成功的细胞，对Amp没有抵抗性，在含有Amp 的培养基上就不能生长。

（2）利用基因插入失活法筛选：质粒PBR322中含有AmpR 及 TetR(抗四环素基因)。在TetR中，含有限制性内切酶 BamHI 的酶切位点，当用这个RE酶切 PBR322 及目的基因，使目的基因插入到 TetR中，于是TetR 失活。结果，重组体转化成功的细胞在含有Amp的培养基上能生长，而在含有Tet的培养基上则不能生长。

（3）利用基因插入表达法进行筛选：质粒PTR262构建重组时，PTR262中含有CI基因，其表达的阻遏蛋白能抑制TetR的表达。CI基因中有RE酶切位点，当插入目的基因构建重组体质，CI基因失活，不能表达出阻遏蛋白。于是TetR去阻遏， TetR表达。结果，转化成功的细胞，在含有Tet的培养基上就能生长。

（4）利用标志补救筛选

标志补救（marker rescue）是指当载体上的标志基因在宿主细胞中表达时，其表达产物能互补宿主细胞的相应缺陷，从而使阳性重组细胞能再相应的培养基中存活。

（5）利用噬菌体的包装特性进行筛选

噬菌载体与目的外源DNA重组时，其总长度应为噬菌体野生型长度的75%—105%时，才能包装成有活性的噬菌体颗粒，于是在培养基上呈现出清晰的噬菌体斑。不含外源目的DNA的噬菌体载体，由于长度太少，不能包装成有活性的噬菌体颗粒，培养基上就看不见噬菌斑。

13、序列特异性筛选阳性重组细胞的方法有哪些？试述之？

答：（1）RE酶切法：从克隆细胞中提取重组DNA，经合适的RE酶切得到大少不同片段，经琼脂糖电泳分离各片段，根据各片段位置不同而比较大小（bp）与标准样比较即可做出筛选。

（2）PCR法：从重组细胞中提取DNA，用特异性引物扩增目的DNA片段，经电泳分离，并与标准目的DNA比较，即可做出筛选。

（3）核酸杂交法：常用的是菌落或噬菌斑原位杂交，将克隆的菌落或噬菌斑印压至硝酸纤维膜（NC膜）上，然后将细菌裂解（酶裂解）释放出DNA，并吸附固

定在NC膜上，将标记的核酸探针与之杂交，通过有无杂交信号（放射自显 影、化学发光等）而确定有无阳性杂交体，进而

确定有无目的DNA存在。

（4）DNA测序法：将分离的重组DNA进行DNA自动测序，与标准序列比较，能准确的鉴定目的DNA。

14、什么是亲和筛选法？

答：亲和筛选法：重组DNA表达出相应的蛋白质，它是抗原或抗体；配体或受体。将这种蛋白质吸附固定在NC膜上，将标记的抗原或抗体；受体或配体作为探针与被探测的蛋白质进行抗原—抗体，配体—受体反应。根据这种蛋白质杂交反应是阳性还是阴性，从而做出检测结果。

15、什么是原核表达体系？大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）表达载体应具备哪些条件？ 答：原核表达体系

原核表达体系与目前常用E.coli表达体系，其优点是培养方法简单，整个工艺过程经济方便。

（1）E.coli表达载体应具备下列条件：

① 含有可供筛选用的选择标志，如Ampr

② 具有强启动子：如 Lac启动子或其它的强启动子序列。这样能转录产生大量的mRNA

③ 含有合适的翻译调控序列：如核糖体结合位点，SD序列等

④含有合适的多克隆位点（MCS），这样保证目的基因按一定的方向与载体进行正确的连接。

16、什么是融合表达体系？有何优点？

答：表达多肽链的C端是克隆目的肽段的DNA编码，N端是原核 …… 此处隐藏：2664字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……