医学分子生物学复习思考题及答案(4)

6、PCR扩增片段长度：复性时两条引物 5’端之间的DNA片段。

9、PCR的主要用途有哪些？试述之。

答：（一）获得目的基因，用于目的基因的克隆

根据目的基因两端的碱基顺序，设计合成一对引物从基因组DNA 或 cDNA中进行 PCR扩增，获得目的基因片段。

（二）体外基因定点突变

根据对突变的要求（点突变、缺失突变等）设计合成相应的突变引物，然后进行分段PCR扩增，最后将分段扩增产物再融合扩增。于是定点突变（引物）就嵌入到基因组中。

（三）对微量DNA及RNA进行分析

在PCR未出现之前，由于微量DNA信号太弱，不易进行分析 。PCR具有高度敏碱性，微量DNA（哪怕是一滴血或一根头发中的一个DNA分子）经PCR扩增后可得到基因的大量拷贝，便于进行定性及定量分析。这在基因诊断、法医中犯罪对象认定及亲子鉴定等方面，都有广泛的应用前景。

（四）DNA序列测定

从基因组DNA经PCR扩增得相应的目的DNA片段后，通过DNA自动测序仪或手工操作法进行DNA直接测序。也可用核酸杂交等方法进行间接测序。

（五）基因点突变分析

1，引物特异性PCR

2，PCR-SSCP（单股链构象多态性）

3，等位基因特异性寡核苷酸探针分析(PCR-ASO)

4，基因芯片技术

10、什么是引物特异性PCR？什么是PCR—ASO？

答：（1）、引物特异性PCR：从基因组DNA经PCR扩增得到目的基因，针对目的基因突变点的碱基性质设计合成 3‘ 端与之互补的引物，又进行PCR扩增，于是，突变阳性的基因有扩增产物，突变阴性的基因，没有扩增产物，称之为引物特异性PCR。等位基因特异性寡核苷酸探针分析(PCR-ASO)：

（2）、PCR 扩增突变基因，合成针对突变点的探针，将它与扩增产物杂交，杂交阳性说明有相应的基因突变存在。

11、什么是RT—PCR？什么是原位PCR？

答：（一）RT—PCR（逆转录PCR）

RT—PCR（reverse transcription PCR）是将 RNA 逆转录反应与 PCR反应联合应用的一种技术。首先，以RNA为模板，经逆转录得到cDNA，再以cDNA为模板，经 PCR 扩增目的基因。目前，RT—PCR是真核细胞mRNA进行定性及半定量分析的有效方法。

（二）原位PCR

原位PCR（in situ PCR）是在组织切片或细胞涂片的细胞内进行PCR。对扩增产物用特异性探针与之进行原位核酸杂交，从而检测出待测DNA或RNA的存在以及存在的部位。虽然这种方法的灵敏度不高，但它是目的基因定位的一个最佳方法。

12、非探针类实时荧光定量PCR的基本原理是什么？

答：原理：在常规PCR时，加入特殊的荧光染料SYBR Green，这种染料能与双链DNA的小沟区域结合。当这种染料未与DNA结合处于游离状态时，荧光信号强度极低。一旦它与双链DNA通过小沟区域结合后，荧光信号大大增强，约为游离时的1000倍。PCR扩增产物双链DNA越多，荧光信号就越强，下一轮循环变性时，双链DNA能形成单链，荧光近消失，待这一轮循环结束，产生双链DNA时，又出现大量荧光。这样，实时记录了荧光量即DNA量。

13、探针类实时荧光定量PCR有哪三种？试述TaqMan探针法的基本原理。

答：根据使用探针不同又分为：TagMan探针法，分子信标探针法及荧光共振能量转移探针法。

TaqMan探针法基本原理：

①在常规PCR反应体系中，加入一条能与模板DNA特异结合的TagMan探针，这个探针的5｀端标记有荧光报告基团R（reporter， R），3｀端标记有荧光淬灭基团Q（quencher，Q）。

②当探针上报告基团R及淬灭基团Q同时存在时，无荧光信号释放。当R基团与Q基团分离时，R基团便能产生荧光信号。

③PCR扩增时，DNA链合必延长，当遇到与模板DNA结合的探针时，Taq DNApol发挥5’ 3’核酸外切酶活性，将探针5‘ 端的R基团水解下来，产生荧光。由荧光检测系统收集。探针余下部分，继续由Taq DNApol 水解切除。PCR扩增继续向前，直至此循环结束。在下一轮循环，产生上述同样过程，收集荧光信号。 ④这样，TagMan 探针就在每一轮PCR扩增时，就实时测定PCR产物的量（荧光量）。

14、什么是基因组DNA文库？什么是cDNA文库？

答：从细胞中提取总基因组DNA，用相应的限制性核酸内切酶酶切，得到大小不同的许多各种基因片段，将这些基因片段分别与相应的基因载体（如噬菌体载体）连接重组。于是形成各种重组体，将所有这些重组体转导入合适的受体细胞中（如大肠杆菌），对受体细胞进行培养扩增，从而获得含有某种生物体全部基因片段的重组DNA克隆群体，它可以涵盖该种生物基因组的全部基因信箱，称之为基因组DNA文库。

从细胞（液）中提取mDNA，通过转录得到相应的各种cDNA 。然后将这些cDNA分别与相应的载体（质粒载体或噬菌体载体）连接，得到各种重组cDNA。将所

有这些重组cDNA转录入合适的受体细胞内进行克隆培养，从而获得多克隆cDNA 片段的混合体。它包含了一种组织细胞中全部mDNA信息。称之为cDNA文库。

15、什么是基因芯片？什么是蛋白质芯片？

答：一、基因芯片（gene chip）技术是以反向点杂交为基础而建立的一种高效高通量的自动化分析技术。其基本原理是：

针对各种基因突变类型合成各种探针以及正常探针，但不对它们进行标记。通过自动化微点样技术将这些未标记的探针依次排列布阵在固相支持载体玻片或尼龙膜上。将待测样品DNA（常来自 PCR）进行荧光标记，与固定在固相支持载体上的各种探针进行微杂交，荧光检测系统对芯片进行扫描收集荧光信号（荧光共聚焦扫描），经计算机软件进行比较分析处理，就可得出检测结果。由于探针布阵密集，1cm2 内可布阵数万个基因，同一时间的一次检测可分析大量基因，故称基因芯片。

二、蛋白质芯片

将针对各种不同蛋白质的相应抗体蛋白作为探针，将这些各种蛋白探针用微点样技术布阵在固相支持载体尼龙膜等上面，形成蛋白质芯片。将待测蛋白质进行荧光标记并与芯片上的各种蛋白质探针进行结合反应，于是特异的蛋白质与它特异的抗体（蛋白探针）之间产生特异的抗原—抗体亲和反应而结合。此时芯片上就可产生特定的荧光信号，通过激光扫描收集荧光信号，再经计算机软件处理就可得出检测结果。

第二十一章 DNA重组及DNA重组技术

1、什么是基因克隆？

答：基因克隆：在体外将目的基因与载体DNA连接起来形成重组DNA（基因重组），然后采用适当的物理、化学及生物学方法将重组DNA导入合适的受体细胞内，通过对阳性受体细胞进行克隆培养，于是，目的基因在受体细胞内不断地复制得到大量基因拷贝，并转录和翻译出相应的目的蛋白质，这一过程称基因克隆及克隆基因的表达。

2、限制性核酸内切酶（Ⅱ型）的作用特点有哪些？

答：（1）RE作用于DNA分子内部，使两条单链水解切断，分别产生5’-P端 及3’-OH端。

（2）RE的识别酶切部位，具有特殊的碱基顺序，通常为4-6个碱基的回文结构（Palindrome），也称反向重复序列。如

EcorⅠ的识别顺序为：

5’—G A A T T C—3’

3’—C T T A A G—5’

（3）切割方式：

在识别部位，切割DNA双链，产生两种不同的末端：

① 粘性末端（粘端）：在识别部位对称的不平齐切开DNA双链，产生单链突出的互补粘性末端：

a，若从5’ 端切割，产生5’端突出的粘性末端，如 BamHⅠ

5‘—GGATCC—3’

3’—CCTAGG—5’

b，若从3’端切割，产生3’端突出的粘性末端。如PstⅠ

5‘—CT …… 此处隐藏：2895字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……