医学分子生物学复习思考题及答案(3)

答：1. eIF-2α磷酸化可抑制翻译的起始，抑制翻译起始复合物的形成。如干扰素的作用机理是 dsRNA可激活蛋白激酶，进而促使eIF-2α磷酸化，从而抑制蛋白质合成的起始；又如血红素能促进珠蛋白合成是由于它能抑制蛋白质激活酶活性，使eIF-2 α磷酸化水平降低。

2. eIF-4E 及 eIF-4E结合蛋白 的磷酸化能激活翻译的起始，促进翻译起始复

合物的形成，增强翻译过程。如生长因子能增加eIF-4E磷酸化，于是翻译加快，促进细胞生长

22、举例说明RNA结合蛋白对翻译过程的调节？

答：RNA结合蛋白（RBP，RNA birding protein）能与 RNA 特异序列结合，从而参与调节翻译过程。如铁反应元件结合蛋白（IRE-BP）（IRE: Iron response element,铁反应元件）与mRNA结合后，能促进ALA合成酶的合成等。

23、miRNA对基因表达有何影响？miRNA的特点有哪些？

答：miRNA（micro-RNA，微小RNA）属于小分子非编码 RNA，长度约20个碱基，它与一些蛋白质共同组成 RNA诱导沉默复合体 RISC（RNA-induced silencing complex）,它能与mRNA结合，从而抑制 mRNA的翻译功能。

miRNA的特点：

(1) 长度为20-25个碱基。

(2) 在不同生物中普遍存在，昆虫、家鼠、人类乃至植物中均含有。

(3) 同一种类生物体内，其序列结构具有一定的保守性，但动植物之间其序列结构不存在一致性。

(4) miRNA 的表达具有明显时间特异性及空间特异性。

(5) miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇形式存在于非编码区，它具有高度多样性。

24、siRNA 对基因表达有何影响？什么是RNAi？

答：siRNA：干扰小RNA是由细胞内的一类双链RNA（dsRNA, double-stranded RNA），在特定条件下，由相应酶的酶切作用，产生了特殊序列的小片段dsRNA，长度约21-23碱基，称之为siRNA。这种双链 siRNA参与组成RISC，并能与特异的靶 mRNA互扑结合，导致mRNA降解，阻断翻译过程。这种由 siRNA介导的抑制基因表达的作用，称之为RNA干扰（RNAi，RNA inlerference）， 它被广泛用于基因功能研究及基因治疗。

第二十章 常用分子生物学技术的原理及应用

1、什么是核酸分子杂交？

答：核酸分子杂交：根据核酸单链片段之间碱基互补而相结合的原理，用一已知碱基顺序的DNA或RNA单链片段作为探针来检测未知待测DNA或RNA中的核苷酸顺序。若对探针进行标记，根据有无标记信号而确定有无杂交体存在。又根据探针的碱基顺序，按碱基配对规则就可以测定待测DNA或RNA的碱基顺序。

2、什么是核酸探针？核酸探针的来源有哪些？探针的标记方法有哪些？

答：（1）核酸探针:核酸探针是一已知碱基顺序的DNA或 RNA单链片段，它能与待测 DNA或RNA 按碱基配对规则进行杂交反应。为了便于观察是否发生杂交反应以及杂交反应的位置及强弱，必须对探针进行标记，从而确定待测核酸（基因）是否存在，进而确定待测核酸的碱基顺序。

(2) 核酸探针的来源

① 人工合成：用核酸合成仪按预定目标合成一已知碱基顺序的寡核苷酸片段，常用的是DNA片段。

② 从基因组获得：用 PCR法扩增基因组中的某个基因片段。

③ cDNA探针：从真核细胞液中提取mRNA，经逆转录得到CDNA, 用cDNA全长或其部分片段作为探针。

④ RNA探针：由于RNA不太稳定，常较少用。

(3) 探针标记

① 放射性核素标记：用放射性同位素标记探针，检测标记信号，采用放射性自显影法。

② 荧光染料标记：用荧光染料物质（如溴乙锭等）标记探针，检测标记信号：能直接看到荧光 或采用特殊仪器收集荧光信号信息（如基因芯片用激光共聚集扫描收集荧光信号）。

③ 生物素标记探针：用生物素标记探针。检测标记信号：生物素分子上连接有特定的酶，加入相应底物后，通过特定酶催化反应过程，产生具有一定有色的物质。

3、什么是Southern印迹？有何应用？简述Southern blotting 的基本过程原理？

答：DNA印迹（DNA blotting）也称southern blotting,是 E.Southern 最先发明使用于检测DNA，顾称之。

其具体过程原理是：

(1) 将待测DNA用限制性核酸内切酶酶切水解得到大小不同的DNA片段。

(2) 将这些片段进行琼脂糖凝胶电泳，大小不同DNA片段停留在凝胶板上的不同位置形成不同的区带。

(3) 将含不同DNA片段的凝胶板放到DNA变性溶液（如0.5mol/L NaOH等）中进行变性处理，使双DNA成为单链DNA

(4) 将凝胶板上的变性DNA转移到硝酸纤维膜（NC膜 ，Nitrocellulose）上：用多量吸水纸吸附的毛细管作用，使凝胶板上DNA转移至NC膜上，由于NC膜具有很强的吸附DNA的作用，一旦胶板上DNA转移到NC膜上时，就能牢固的吸附在膜上，并保持原来位置不发生变化。

(5) 将转移后的NC膜经80℃真空加热或紫外交联仪处理，DNA就能非常牢固的固定在NC膜上，便于进行杂交。

(6) 杂交反应：将标记的探针与NC膜进行杂交，68℃杂交12小时。

(7)杂交信息监测：放射自显影或荧光信号监测确定有无杂交体、杂交体的位置及强弱。

应用：根据探针的碱基顺序确定目的基因的碱基顺序，对相关基因进行定性分析，还能进行定量析，以及对重组质粒进行分析等。

4、什么是Northern印迹？有何应用？Northern印迹与Southern印迹有何异同？

答：RNA印迹（RNA blotting）也称Northern Blotting，其基本过程及原理与Southern blotting 相同，只是监测对象由 DNA换成 RNA。由于被检测RNA分子较小，常无需限制性内切酶来酶切。电泳RNA转移至NC膜上以及杂交信息的检测，都与Southern blotting 相同。由于RNA极不稳定，易受RNA酶降解，因此实验过程中要加入RNA酶 抑制剂DEPC(焦磷酸二乙酯，diethlpyrocarbonate)

应用:主要用于RNA定量分析

(1) 检测组织细胞中某一已知的特异 mRNA的表达水平

(2) 比较不同组织细胞中同一基因（ mRNA ）的表达情况

5、什么是Western印迹？有何应用？Western印迹的基本过程原理是什么？ 答：蛋白质印迹常称为Western blotting（与Southern blotting, Northern blotting 相对应）。由于检测蛋白质不是用探针，而是用该蛋白质特异的相应抗

体。因此，也称免疫印迹（immoublotting）。

1. 实验原理：

（1）将混合组分蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将各组分逐一分开停留在凝胶的不同区带

（2）通过转移电泳方法（与DNA，RNA转移方法不同）将凝胶板上的各组分蛋白质转移至NC膜上。

（3）用被检蛋白质相应的特异性抗体（称第一抗体）与NC膜上的各组分蛋白质进行免疫反应。于是，特异性抗体就与NC膜上相应的特异性蛋白质结合成抗原—抗体复合物。

（4）用与第一抗体相对应的特异性第二抗体，将它进行碱性磷酸酶标记或辣根过氧化物酶标记或放射性核素标记。将这种标记的第二抗体与第一抗体—抗原复合物反应。于是标记了的第二抗体就与第一抗体进行特异性的结合。形成了三种物质的三元复合物。

（5）印迹信号的检测：

① 显色检测：加入相应的底物，在碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶的作用下，使底物反应产生具有一定颜色的物质。

② 放射性自显影检测：用于放射性核素标记信号的检测。

2.应用：

（1）蛋白质特别是微量蛋白质的定性检测：一复合物组分蛋白质中含有微量的目的蛋白质时，可用Western blotting 进行定性检测。

（2）特异蛋白质的半定量分析：特异蛋白 …… 此处隐藏：2992字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……