柴油机喷油器常见故障及维修要点(3)

蛋白maltoporin仅允许麦芽糖或麦芽寡糖通过大肠杆菌外膜。

筒大多为转运蛋白。有些较小的 桶其孔道完全被突向腔心的侧链充满，这些 桶

起受体或酶的作用，这时 桶只是一种形式，使膜蛋白牢固锚定在膜上，并使胞质环的

区段有合适的定向位置，能被一些特异的细胞内分子结合。虽然 桶可以有多种功能，

它们主要分布仍限于线粒体、叶绿体外膜。真核细胞和细菌的主要的跨膜蛋白还是由跨

膜 螺旋构成的。 螺旋可以滑动，可以造成较大的构象变化，从而产生将离子通道开

放、关闭的效果，来运输特定的物质，或传导细胞外信号入细胞。与此相反， 筒通过

氢键紧密地与周边结构相联，本身不易发生构象改变。

3．膜蛋白的糖基化 动物细胞的绝大部分跨膜蛋白是糖基化的。前已述及，膜蛋

白和糖脂一样，其糖基是在内质网和高尔基体的腔内加上去的，所以，寡糖链总是位于

膜的非胞质面。

（三）膜蛋白研究的常用方法

1．用去垢剂分离提取 一般来说，要溶解跨膜蛋白或紧密结合于膜上的蛋白，必

须使用能打破疏水键并破坏脂双层的试剂，其中最常用的就是去垢剂。用去垢剂分离提

取跨膜蛋白，是膜蛋白研究的重要手段。去垢剂是小的亲水脂分子，当它们与膜蛋白作

用时，其疏水端与膜蛋白的疏水区域相结合，极性端指向水中，形成溶于水的去垢剂-

膜蛋白复合物，从而可使膜蛋白在水中溶解、变性、沉淀。当去除去垢剂并加入磷脂

后，可使膜蛋白复性并恢复功能。极性去垢剂有离子型和非离子型两种，前者如

SDS ，后者如Triton。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术利用离子去垢剂SDS对膜蛋白的

强有力分离作用达到纯化、分析的目的，是膜研究手段的重大革新。

2．利用血影细胞鉴定跨膜蛋白及其分布 膜研究的最主要材料来源是动物的红细

胞。其原因是：①红细胞易于大量而纯净地获得，而其他组织多有各种细胞混杂；②红

细胞无核、无细胞器，可得到单纯的质膜，而其他细胞中各种内膜占总量的95%；③

不含细胞质的红细胞即血影细胞，制备方便，只需将细胞置于低渗溶液中，细胞就肿胀

破裂，血红蛋白就释出，从而去除了材料中的膜以外蛋白成分；④血影细胞可以处理成

破漏的、重新封闭的等不同状态，也可制成内面在外的小泡来研究（图6－9）。这

样，使各种化学物质可以分别只与膜的内面或外面接触，也可同时与内、外面接触。

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柴油机喷油器常见故障及维修要点

图6－9 不同封闭状态的血影细胞和小泡的制备

（引自B.Alberts等，2002年）

参照前书图9-9

要了解某个膜蛋白是否属跨膜蛋白，位于膜的哪一面以及它的分子量、带电状况

等，有以下数种方法可采用：①用一种水溶性的共价结合物如放射性物质或荧光素标记

膜蛋白，该物质不能穿入脂双层，只共价结合于膜表面的某些基团，然后用SDS聚丙

烯酰胺凝胶电泳分离膜蛋白，所标记的蛋白因放射性或荧光存在就清楚地显示出它处在

电泳凝胶上某一带。它在膜上的情况是这样获知的：先使标记物与完整的细胞作用，从

外面接触膜，再使标记物与内面向外的小泡作用，从内面接触膜。如果这两种情况都得

到同一标记电泳带，说明这个膜蛋白是个跨膜蛋白；如果只在一种情况下得到这一标记

电泳带，说明这个膜蛋白位于膜的内面或外面。②用一种不能透过膜的蛋白水解酶分别

接触膜的内、外面，如果某一蛋白在两种情况下都被水解，则这是一个跨膜蛋白。③用

标记抗体分别接触膜的内、外面，如果两面都有特异结合，则是跨膜蛋白。

3．冷冻蚀刻技术 又称冷冻断裂蚀刻技术，该技术将细胞膜冷冻、断裂和蚀刻后

制成复型膜在透射电镜下观察，提供在一定膜区域内膜蛋白数目、大小的信息，特别重

要的是提供膜蛋白在膜的两个半层的分布位置的信息。图6－10A示意了该技术的原理

和断裂表面的命名（参见第二章电子显微镜技术节）。例如，用冷冻蚀刻技术制备红细

胞质膜的复型膜，可以看到在两个断裂面上有散在的大小均匀的斑点，斑点直径约

7.5nm，在P面上比E面上更集中些，这些都是带3蛋白（详见下述）。因为把提纯的

带3蛋白整合进人工合成的脂双层后，其冷冻断裂面上也同样能看到这种斑点。在两个

半层被断裂劈开时，膜蛋白颗粒往往留在本身大部分所在的那个半层上，从对面半层中

“拔”出来的那部分就突起在断裂面上，如果这部分足够大，就能被看到，由此可以推

断膜蛋白所在半层和膜蛋白的结构特点。图6－10B可说明在冷冻断裂技术制备的红细

胞膜上，为什么能看到带3蛋白而看不到血型糖蛋白之类的膜蛋白。血型糖蛋白的大部

分伸出在质膜外表面，突出在断裂面上的那部分很小，因而不能被看到。

图6－10 冷冻蚀刻技术原理和显示的膜蛋白

（引自Alberts等，2002）

参照前书图9-10

4．光漂白后荧光素复原和光漂白中荧光素丢失 膜蛋白侧向扩散速率是用一种叫

做“光漂白后荧光素复原”（FRAP——fluorescence recovery after photo-bleaching）的

技术来测量的。此法最早用来测量视紫红质分子的扩散。方法是用一束强光照射排列着

视紫红质分子的细胞膜一部分，被照的这些分子中的发色基团就被漂白，经过很短的时

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间，被漂白和未被漂白的视紫红质分子就互相扩散、混合分布了（图6－11），从中计

算出视紫红质分子的扩散系数为5 10-9cm2/s 。测量其他膜蛋白时，可以把荧光素经特

异性抗体连接到该膜蛋白分子上，也可以用重组DNA技术使膜蛋白与绿色荧光蛋白

（GFP）融合后表达。小块区域内膜蛋白上的荧光物质被激光束照射后漂白，邻近区域

未漂白的膜蛋白就扩散进入漂白区域，荧光复原所花的时间就用这种技术得到测量。与

此互补的一种技术叫作“光漂白中荧光素丢失” （FLIP——fluorescence loss in photo-

bleaching），在此，荧光持续照射一小块膜区域，使不断扩散进入的所有荧光素漂白，

从而渐渐耗尽周围膜上所有的荧光素标记分子。在此过程中对照射区邻近的非照射区进

行荧光强度的测量，即可获得膜蛋白分子的扩散系数。

图6－11光漂白后荧光素复原和光漂白中荧光素丢失技术

（引自Alberts等，2002 ）

参照前书图9-11

5．重组DNA技术 要获得一个多次跨膜蛋白的X线晶体成像图是很困难

的，因此，这类分子的三维结构大多不为人所知，它们执行功能的分子机制，比如运输

蛋白如何将离子运送过膜，也无法由此了解。但是，其他一些技术提供了不少信息，其

中最重要的技术就是重组DNA技术。

编码运输蛋白的DNA一旦被克隆和测序，人们就能分析出其肽链的氨基酸序列，

然后就能用亲水图谱（hydropathy plot）推算出其跨膜螺旋的数目（详见下述）。针对

肽链特异片断合成的抗体，可以用来鉴定特异片断显露于膜的哪一侧。在编码特异片断

肽链的DNA序列上制造突变，再把相应的突变mRNA注射进培养的哺乳动物细胞或爪

蟾卵母细胞，这些细胞合成的突变蛋白可用来研究膜蛋白功能和结构改变的关系，特异

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