系统性红斑狼疮(9)

第二章 实验材料很方法

孔比例。（一般为1:2，即96孔板一孔转入48孔板一孔）小心弃去原培养基，加入新的含有IL-2 (2 ng/ml)的新培养基，重悬细胞至新的48孔板中，置细胞培养箱中培养。

（7）5天后收集细胞：弃去培养基，用PBS重悬细胞至流式管中，离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清 2.2.10.3 Treg染色 2.2.10.4 流式细胞仪检测

2.2.11 小鼠Th1细胞的分化培养和染色

2.2.11.1 制备小鼠脾细胞单细胞悬液 2.2.11.2 分化培养

（1）包板：用anti-CD3 （10ug/ml） 包被96孔板，50μL/孔，37℃2h或者4℃过夜。

（2）细胞计数，调整细胞浓度至2.5×106个/ml。

（3）细胞悬液中加入细胞因子anti-CD28 （1 ug/ml）、IL-2 （2 ng/ml）, IL-12 （5 ng/ml） 和anti-IL-4 （10 ug/ml）。

（4）将细胞悬液加入细胞培养板，200μL/孔，置细胞培养箱中培养。 （5）2天后换液转孔：小心弃去原培养基，加入新的含有IL-2 （2 ng/ml）的新培养基，重悬细胞至新的96孔板中，置细胞培养箱中培养

（6）3天后换液分孔：显微镜下观察细胞生长状态，根据细胞生长状态确定分孔比例。小心弃去原培养基，加入新的含有IL-2 （2 ng/ml）的新培养基，重悬细胞至新的48孔板中，置细胞培养箱中培养。

（7）5天后再刺激：anti-CD3 （10ug/ml）预包板，50μL/孔，37℃2h或者4℃过夜。（anti-CD3（10ug/ml）用RPMI-1640稀释）弃去原培养基，加入含有anti-CD28 （1 ug/ml）、IL-2（2 ng/ml）的新培养基，重悬细胞至新的包被板中，细胞培养箱中培养4h。

（8）阻止蛋白分泌：加入Golgi-plug（1μL/mL），细胞培养箱中培养2h。 （9） 收集细胞：弃去培养基，用PBS重悬细胞至流式管中，离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清 2.2.11.3 染色

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第二章 实验材料很方法

（2）固定：用PBS配制的2%的甲醛溶液重悬，2ml/管，室温30min。离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清。

（3）洗涤：加入3mL PBS，离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清。 （4）再洗涤：加入3mL PBS，离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清。 （5）打孔：用PBS配制的0.5%的Saponin溶液重悬，2ml每管，避光室温打孔30min。离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清。（Saponin溶液的配制：先在50ml离心管中加入3ml的PBS，然后称量所需的Saponin粉末倒入50ml离心管中，补加入所需的PBS，将其放在冰上等其自然溶解，不可以摇晃否则会产生大量泡沫。且由于Saponin是有毒物质，又呈粉末状，配制时应该带上口罩，防止吸入鼻腔和口腔内对身体造成危害）

（6）染色：加入0.25μL APC标记的CD4+的抗体和0.25μL FITC标记的IFN-γ抗体，另准备一个空白管，一个单染管只加APC标记的CD4+的抗体，一个单染管只加FITC标记的IFN-γ抗体。避光4℃染色30min。

（7）Saponin溶液洗涤：加入用PBS配制的0.5%的Saponin溶液重悬，2ml每管，离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清。 （8）Saponin溶液洗涤再洗涤一次。 （9）PBS溶液洗涤一次。

（10）样品管用200μLPBS重悬，空白管和单染管用300μLPBS重悬。

2.2.12 小鼠BMDC细胞分化培养、刺激和共培养

2.2.12.1 小鼠BMDC细胞的分化培养（除了第一步其余应在超净工作台无菌环境下进行）

（1）小鼠脱臼处死，取两个后肢，包括股骨、胫骨和腓骨，置含有3ml左右PBS的平皿中。（用75%酒精喷湿小鼠体表，用剪刀和镊子从中央剪开腹部皮肤，小心用手撕拉皮肤至脚部，用剪刀剪除皮肤，从下剪除脚掌，注意不要剪断胫骨和腓骨，从上剪断股骨处，注意不要剪断股骨）

（2）用剪刀去除腿上的大部分肉，再使用的Kimwipe纸尽可能清洁骨上残余的肉，然后把骨头放在含有3ml左右PBS的平皿中 。

（3）剪刀剪开骨的两端，用2.5毫升注射器冲洗骨髓至含有10ml左右PBS的15ml离心管中。

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第二章 实验材料很方法

（4）离心（4℃，1800rpm，7min），弃上清。 （5）加入3ml红细胞裂解液重悬，室温放置10min。 （6）离心（4℃，1800rpm，7min），弃上清。

（7）10ml RPMI-1640重悬，细胞过滤器过滤置新的15ml离心管中。 （8）离心（4℃，1800rpm，7min），弃上清。 （9）10ml含5?S的RPMI-1640重悬。 （10）加入GM-CSF（10 ng/ml），混匀。 （11）加入细胞培养皿中，置细胞培养箱中培养。

（12）2天后换液换皿：从细胞培养箱中小心取出培养的细胞，显微镜下观察细胞生长状态。小心弃去7ml上清（注意倾斜细胞培养皿，枪头贴着侧壁小心吸取培养基，不要扰动下层细胞）。在新的细胞培养皿中加入5ml新配置的含有GM-CSF（10 ng/ml）和5?S的RPMI-1640培养基。用枪将剩下的3ml培养基（由于细胞培养箱中的蒸发，实际剩余体积肯能小于3ml）轻轻吹打细胞培养皿上的细胞，转移至新的细胞培养皿中。用2ml新配置的含有GM-CSF（10 ng/ml）和5?S的RPMI-1640培养基冲洗一下残余细胞并转移至新的细胞培养皿中。 （13）4天后换液不换皿：从细胞培养箱中小心取出培养的细胞，显微镜下观察细胞生长状态，小心弃去7ml上清（注意倾斜细胞培养皿，枪头贴着侧壁小心吸取培养基，不要扰动下层细胞），加入7ml新配置的含有GM-CSF（10 ng/ml）和5?S的RPMI-1640培养基（注意加培养基是枪头贴着培养皿侧壁，缓慢加入，不要扰动下层细胞）。 （14）6天后换液不换皿。

（15）7天后收细胞：显微镜下观察细胞可见细胞有的呈圆形，有的呈树突状。BMDC细胞是半贴壁细胞，用枪轻轻吹打细胞培养皿底部，转移至15ml离心管中。离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清。 2.2.12.2 小鼠BMDC的体外刺激

（1）3ml左右含有GM-CSF（10 ng/ml）和5?S的RPMI-1640培养基重悬，细胞计数，调整细胞密度至2×106/mL。

（2）ALD-DNA （50ug/ml）、unALD-DNA （50ug/ml）、LPS （100 ng/ml）、CpG （10 ug/ml）、None刺激BMDC细胞。

（3） 将细胞悬液加入细胞培养板24孔板，1ml/孔，置细胞培养箱中培养24h。 （4）收取上清，ELISA检测细胞因子和dsDNA抗体

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第二章 实验材料很方法

2.2.12.3 刺激的BMDC的上清做小鼠脾细胞向Treg的分化培养

（1）上述收取的不同条件刺激的BMDC的上清100μL和100μL含10?S的RPMI-1640培养基混合，做小鼠脾细胞向Treg的分化培养。

（2）每个条件做3个复孔，一个不加、一个加anti-IL-6抗体、一个加anti- TNF-a抗体。

（3）收取细胞，流失细胞分析Treg细胞的分

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第三章 实验结果

第三章 实验结果

第一节 构建系统性红斑狼疮模型

3.1.1 dsDNA的检测

取6-8周的雌性C57小鼠10只，分为实验组和对照组，每组5只；分别用ALD-DNA和PBS免疫小鼠；在2、4、6、8、10、12、14周静脉取血，测量血清中的dsDNA的含量。结果可见，ALD-DNA免疫的小鼠较对照组PBS免疫的小鼠，血清中含有更多的dsDNA（图3.1）。

0.4OD4500.30.20.10.02C57 ALDC57 PBS***46*81214weeks post stimulate图3.1 ALD-DNA免疫小鼠血清中dsDNA抗体的含量

3.1.2 尿蛋白的检测

实验组ALD-DNA免疫的小鼠和对照组PBS免疫的小鼠，在2、4、6、8、10、12、14周取尿，检测尿蛋白的含量。结果可见ALD-DNA免疫的小鼠较对照组PBS免疫的小鼠尿蛋白的含量增多（图3.2）。

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