系统性红斑狼疮(7)

第二章 实验材料很方法

FITC标记的IFN-γ抗体：(clone XMG1.2) Biolegned (San Diego, CA) Fixation、Perm：eBioscience (San Digeo,CA) anti-CD3： anti-CD28：

IL-2：R&D Systems (Minneapolis,MN) TGF-β：PeproTech (Rocky Hill, NJ) IL-12 ：PeproTech (Rocky Hill, NJ) anti-IL-4 ：

anti-IL-6: (clone MP5-20F3) Biolegned (San Diego,CA) anti-TNF-a: (clone XT3.11) Biolegned (San Diego,CA). Golgi-plugBecton Dickinson(San Jose, CA) 甲醛溶液：天津市大茂化学 Saponin溶液：Sigma-Aldrich

GM-CSF：PeproTech (Rocky Hill, NJ) LPS、CpG：InvivoGen (San Diego, CA)

2.1.3 实验仪器

Cell Strainer 40μm Nylon：BD Falcon 15ml 离心管、50ml 离心管： BD Falcon 细胞培养板：BD Falcon 细胞培养皿：BD Falcon 细胞培养瓶：BD Falcon

HEPA Class 100 CO2细胞培养箱：Thermo 超净工作台：ESCO 制冰机：Scotsman 移液枪：Eppendorf

水平转头台式离心机Centrifuge 5810R：Eppendorf 小型高速离心机Centrifuge 5418 ：Eppendorf MultiScan MK3酶标仪：Thermo 倒置荧光显微镜CKX32：Olympus -80℃超低温冰箱：Thermo -20℃低温冰箱：海尔 4℃冰箱：海尔

1ml注射器、2.5毫升注射器：洪达

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第二章 实验材料很方法

毛细管：华西医科大学仪器厂 酶标板：Nunc,Denmark 流式管：BD Falcon

流式细胞仪FACSCalibur：BD MLS-3750 高压灭菌锅：SANYO 电子天平BT 125D：Sartorius

Milli-Q Biocel-A10 纯水系统：Millipore

第二节 实验方法

2.2.1 DNA的制备

2.2.1.1 小鼠脾脏单细胞悬液的制备（除第一步外，其余在超净工作台无菌环境中进行）

（1） 取10只左右C57BL/6小鼠脱臼处死，取脾脏置含有30ml 左右RPMI-1640

的50ml离心管中。（注意取脾脏时小心去除黏连的其它组织）

（2） 用玻片将脾脏研碎于细胞培养皿中。（每次用玻片切割一小块脾脏组织，

碾磨充分以尽可能获得脾脏细胞，用力不要过大防止破坏细胞结构） （3） 用细胞过滤网过滤至新的50ml离心管中。 （4） 离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清。

（5） 加入红细胞裂解液重悬，3ml/脾脏，室温放置10min。（可先加1ml红细

胞裂解液将沉淀吹打混匀，再加入其余红细胞裂解液，颠倒混匀） （6） 用细胞过滤网过滤至新的50ml离心管中。 （7） 离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清。 （8） 加入30ml左右含10?S的RPMI-1640重悬 2.2.1.2

ConA刺激小鼠脾脏单细胞悬液（超净工作台无菌环境中进行）

（1） 细胞计数，调整细胞浓度至2×106/mL。（细胞计数可以将脾脏单细胞悬液

稀释50倍再计数，防止细胞浓度过大，视野中细胞数量过多。细胞浓度=（对角线2个16格细胞总数/2×104×稀释倍数）/ml）

（2） 将脾脏单细胞悬液均等分为2份，分别用和不用ConA(5μg/mL)刺激。用

ConA刺激的为脾脏单细胞悬液提取出来的是ALD-DNA，不用ConA刺

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第二章 实验材料很方法

激的脾脏单细胞悬液提取出来的是unALD-DNA） （3） 加入细胞培养瓶中，置细胞培养箱中培养7天。 2.2.1.3 DNA的提取

（1） 收集上述细胞至50ml离心管中，离心（4℃，1500rpm，7min），弃上清。 （2） 用30ml PBS重悬，离心（4℃，4000rpm，5min），弃上清。

（3） 加入1ml PBS将沉淀吹打混匀，加入细胞裂解液24 mL/管、蛋白酶K

240μL/管、Rnase 160μL/管，包好封口膜，置37℃水浴中12～24小时。（加入细胞裂解液后，脾脏单细胞悬液变得粘稠，应尽力多吹打几次，使细胞充分裂解）

（4） 加入等体积的平衡酚，混匀，离心（4℃，10000rpm，15min），转移上

层水相。（转移上层水相时，枪头应尽量沿着液面缓慢向下移动，尽量不要吸到下层）

（5） 重复用平衡酚抽提1次。

（6） 加入等体积的氯仿/异戊醇混合液（体积比24/1配制），混匀，离心（4℃，

10000rpm，15min），转移上层水相。

（7） 加入1/10体积的乙酸钠（3mol/mL，pH5.2）和2～2.5倍体积的无水乙

醇，用力混匀。（混匀后可以看见DNA呈絮状）

（8） 置-20℃冰箱中冻存至少1个小时 （时间长有利于DNA析出）。 （9） 离心（4℃，10000rpm，15min），弃上清。

（10） 沉淀转移至1.5ml离心管中，加入1ml 75%乙醇洗涤，混匀，离心（4℃，

10000rpm，15min），弃上清。

（11） 重复乙醇洗涤一次，室温自然晾干。（晾干时间一般为3小时左右） （12） 沉淀溶于1ml的含RNA酶(20μg/mL)的无菌水中，-20℃保存。 （13） 用Nano-drop检测其在260nm的吸光度（A）以计算其浓度，并且A260/280

应大于1.8。

2.2.2 小鼠系统性红斑狼疮模型的构建

2.2.2.1 DNA-佐剂乳化液的制备

（1）等体积的DNA和弗式完全佐剂（CFA）或弗式不完全佐剂（IFA）混合，用1ml注射器反复抽吸混匀。

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第二章 实验材料很方法

（2）滴一滴在水中，若形成“油包水”状不散开则乳化完成，乳化时间一般需要4小时左右。 2.2.2.2 小鼠的免疫

（1）初次免疫DNA-弗式完全佐剂乳化液，DNA（50μg/mice），200?L每只小鼠，背部皮下注射。

（2）第二周和第四周再次免疫，DNA溶液与弗式不完全佐剂乳化液，DNA（50μg/mice），200?L每只小鼠。 （3）对照组小鼠每次注射等计量的PBS。 2.2.2.3 小鼠发病状况的检测

（1）每两周小鼠眼静脉取血制备血清检测ds-DNA含量。（血清的制备：一毛细管约100?L血液，置于1.5ml离心管中；4℃过夜或者室温0.5h；离心（3800rpm，15min），取上清；离心（3800rpm，5min），取上清）

（2）每两周小鼠取尿检测尿蛋白含量。（取尿时应注意，要迅速抓住小鼠，将其放在一张锡箔纸上，小鼠由于害怕会产生拍尿反应，若小鼠无尿则可以用手轻轻按压腹部促进拍年反应）

（3）14周后处死小鼠取肾脏做病理切片。

2.2.3 dsDNA抗体的检测

2.2.3.1 溶液的配制

（1）PBST：PBS+0.5%Tween-20 （2）封闭液：PBST+5%羊血清

（3）稀释液：PBST+5%羊血清+10%小牛血清 （4）羊抗鼠IgG-HRP：用稀释液稀释1：2000稀释 （5）底物TMB：A液和B液等量混合 （6）终止液：28ml浓硫酸加入500ml水中 2.2.3.2 实验步骤

（1）酶标板处理：酶标板用0.5%的硫酸鱼精蛋白处理，100μL/孔，37℃震荡1h。用300?L PBST洗涤1次，控干。（洗涤时先将溶液弃去，然后在吸水纸上拍打几次；使用排枪时应注意观察每个枪头内溶液的液面是否一致）

（2）包板：S1核酸酶处理后的小牛胸腺dsDNA按50μg/mL作为包被抗原，100μL/

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第二章 实验材料很方法

孔，37℃震荡2h，置于4℃冰箱过夜。PBST洗涤3次，控干。

（3）封闭：加封闭液，100μL/孔，37℃震荡1h。PBST洗涤1次，空干。 （4）待测物：加待测物，100μL/孔，37℃震荡2h。PBST洗涤3次，控干。（如果是血清用稀释液1:50稀释，如果是细胞培养上清则不用稀释。加样时应避免错漏孔，加样完毕尽快记录加样顺序）

（5）加检测抗体：加羊抗鼠IgG-HRP，100μL/孔，37℃震荡1h。PBST洗涤4次，控干。

（6）显色：加配好的 …… 此处隐藏：2495字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……