系统性红斑狼疮(8)

第二章 实验材料很方法

2.2.4.3 实验步骤

（1）分别取25μL标准品稀释液和待测样品加入到96孔板中。 （2）加入200μLBCA工作液，充分混匀。

（3）37℃孵育30min后，冷却至室温或者室温放置2h。 （4）用酶标仪检测其在562nm处的吸光度。 （5）根据标准曲线计算样品中蛋白质的浓度。

2.2.5 肾脏病理切片的制作

（1）取材：小鼠脱臼处死，取肾脏，切取中间组织，既要包括皮质也要包括髓质。组织应尽量保持新鲜，最好在处死小鼠30min以内。刀锋应保持锋利，避免来回切割，损坏组织。组织的大小应适宜，厚度在05mm左右，大小不要超过15mm×15mm。

（2）固定：将肾脏放入含有10ml 4%多聚甲醛的15ml离心管中，固定24h。固定可保持组织细胞内的蛋白质、糖、脂肪等物质保持原有形态；使组织块变硬有利于后续操作；防止组织自溶和细菌的腐蚀；对于一些传染性的标本杀灭病原体防止传染。

（3）冲洗：流水冲洗12-24h。冲洗可洗去固定液，组织中的固定液会妨碍染色。 （4）脱水：70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、100%无水乙醇、100%无水乙醇，每步2h，此补步骤可以在脱水机中完成。经过冲洗后的组织块含有大量水分，水不溶于石蜡妨碍包埋，乙醇可以与水以任意比例互溶，故用从低浓度到高浓度的乙醇置换组织块中的水分。

（5）透明：二甲苯与无水乙醇等体积混合液中1h，4℃二甲苯中1h，室温二甲苯中1h。无水乙醇步溶于石蜡妨碍包埋，二甲苯即溶于无水乙醇又溶于石蜡，故用二甲苯将组织块中的无水乙醇置换出来。

（6）浸蜡：二甲苯与石蜡等体积混合液中1h，石蜡中1h，石蜡中1h，温度应该比石蜡的熔点高3℃的恒温箱中，一般石蜡的熔点为52-56℃。用石蜡替换组织块中的二甲苯，二甲苯会产生结晶，使组织在切片时产生断裂。

（7）包埋：调整组织块在包埋盒中的位置，置于石蜡中包埋。包埋时石蜡温度不宜过高，否则会使组织变脆变硬，妨碍后续切片甚至诊断

（8）切片、展片、捞片、烤片：用切片机将组织块切成5-10μm，用镊子将其放

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第二章 实验材料很方法

倒温水上展开，待其完全展开后使其粘附到载玻片上，然后置60℃温箱中30min。 （9）HE染色：脱蜡、脱苯、复水、染色、脱水、透明、封固。苏木精是一种碱性染料，可与细胞中的酸性物质如细胞核中的脱氧核糖核苷酸结合，呈蓝色。依红是一种酸性染料，可与细胞中的碱性物质如细胞质中的蛋白质结合，呈红色。

（10）镜下照相。

2.2.6 ELISA检测

按照Biolegned (San Diego, CA)的ELISA试剂盒说明书进行操作

2.2.6.1 实验原理：抗体（抗原）吸附在固相载体上，加待测抗原（抗体）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗体（抗原）－待测抗原（抗体））－酶标记抗体（抗原）的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物，酶标仪检测的吸光度与待测抗原（抗体）量成正比。 2.2.6.2 溶液配制

（1）包被缓冲液：用去离子水把5×包被缓冲液稀释成1×。一个96孔板配制12ml，2.4ml 5×包被缓冲液加入9.6ml去离子水中。

（2）稀释液：用PBS把5×稀释液液稀释成1×。一个96孔板配制50ml，10ml 5×稀释液加入40ml去离子水中。

（3）标准品：储存：买的标准品粉末首先溶于0.2ml的稀释液中，一个96孔板用量分装一个八连管小管中，置于-80℃中保存。使用：将存储液拿出，按照不同检测物的说明书要求，配制1ml 浓度为500pg/ml的最高浓度溶液，再倍比稀释6管至浓度为7.8pg/ml。

（4）包被抗体：用包被缓冲液1:2000稀释。一个96孔板配制12ml，60μL包被抗体加入11.94ml包被缓冲液中。（在15ml离心管中加入12ml包被缓冲液，弃去60μL包被缓冲液后，再加入60μL包被抗体）

（5）检测抗体：用稀释液1:200稀释。一个96孔板配制12ml，60μL检测抗体加入11.94ml包被缓冲液中。

（6）Avidin-HRP的配制：用稀释液1:1000稀释，一个96孔板配制12ml，12μL Avidin-HRP加入11.99ml稀释液中。

（7）底物TMB：A液和B液等量混合。一个96孔板配制12ml，6ml A液加6ml

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第二章 实验材料很方法

B液。（加A、B液时一定要记得换枪头，加完混合后置于暗处） （8）终止液： 2.2.6.3 操作步骤：

（1） 包板：加入包被抗体100μL/孔，4℃过夜。PBST洗涤4遍，控干。 （2） 封闭：加入稀释液200μL/孔，室温震荡1h。PBST洗涤4遍，控干 （3） 加入标准品和待测物：100μL/孔，室温震荡2h。（如果是血清用稀释液1:50

稀释，如果是细胞培养上清则不用稀释）PBST洗涤4遍，控干 （4） 加入检测抗体：100μL/孔，室温震荡1h。PBST洗涤4遍，控干 （5） 加入Avidin-HRP： 100μL/孔，室温震荡30min。PBST洗涤5遍，控干 （6） 显色：加入TMD100μL/孔，置暗处显色15-30min。 （7） 终止反应：加入终止液100μL/孔

（8） 检测：紫外分光光度计检测其在450nm处的吸光度 （9） 计算：根据标准曲线计算待测物的浓度

2.2.7 小鼠脾细胞体外刺激

2.2.7.1 制备小鼠脾脏单细胞悬液

（1） 小鼠脱臼处死，取脾脏置含有10ml 左右RPMI-1640的15ml离心管中。 （2） 用玻片将脾脏研碎于细胞培养皿中。 （3） 用细胞过滤网过滤至新的15ml离心管中。 （4） 离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清。

（5） 加入红细胞裂解液重悬，3ml/脾脏，室温放置10min。 （6） 用细胞过滤网过滤至新的15ml离心管中。 （7） 离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清 （8） 加入3ml左右含10?S的RPMI-1640重悬 2.2.7.2 体外刺激

（1）细胞计数，调整细胞浓度至5×106个/ml。

（2）ALD-DNA(50 μg/ml)、unALD-DNA(50 μg/ml)、none刺激脾脏细胞 （3）将细胞悬液加入细胞培养板24孔板，1ml/孔，同一个条件做6个复孔，置细胞培养箱中培养6天。

（4）每天收取6个复孔中的1孔上清，ELISA检测细胞因子和dsDNA抗体

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第二章 实验材料很方法

2.2.8 小鼠CD4+T细胞活化状态的染色

2.2.8.1 制备小鼠脾脏单细胞悬液

（1） 小鼠脱臼处死，取脾脏置含有3ml 左右PBS的流式管中。 （2） 用玻片将脾脏研碎于细胞培养皿中。 （3） 用细胞过滤网过滤至新的流式管中。

（4） 离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清。（先倒去上清，然后将管口倒置

在吸水纸上，不可反复震动流式管防止将细胞弃去） （5） 加入红细胞裂解液重悬，3ml/脾脏，室温放置10min。 （6） 离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清。 2.2.8.2 制备小鼠淋巴结单细胞悬液

（1） 小鼠脱臼处死，取腹股沟及腋下淋巴结，置含有3 ml 左右PBS的平皿中。

（用75%酒精先喷湿小鼠体表，用剪刀和镊子从中央剪开小鼠腹部皮肤，小心用手撕拉皮肤置腹股沟及腋下，可见淋巴结，用镊子小心夹取淋巴结，不可用力过大否则淋巴结破碎）

（2） 用玻片研磨碎。（淋巴结相对于脾脏比较好研磨，轻轻研磨几下就可以） （3） 用细胞过滤网过滤置流式管中。 （4） 离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清。 2.2.8.3 表面染色

（1）加入50μL PBS重悬。

（2） 加入0.25μL APC标记的CD4+的抗体、0.25μLμLPerCP标记的CD44抗体、0.25μL FITC标记的CD62L抗体，混匀。设置一个空白管不加抗体，一个单染管只加APC标记的CD4+的抗体，一个单染管只加PerCP标记的C …… 此处隐藏：2778字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……