实验四 - - 高效液相色谱实验(3.7)

实验一 高压液相色谱系列实验

一、实验目的

1．熟悉岛津 液相色谱仪的整套装置、工作原理、工作流程；会较熟练操作和使用LC Solution工作站。

2．掌握外标法测定植物胡萝卜素的实验方法。 二、 实验原理

液相色谱法就是同一时刻进入色谱柱中的各组分，由于在流动相和固定相之间溶解、吸附、渗透或离子交换等作用的不同，随流动相在色谱柱中运行时，在两相间进行反复多次（103～106次）地分配过程，使得原来分配系数具有微小差别的各组分，产生了保留能力明显差异的效果，进而各组分在色谱柱中的移动速度就不同，经过一定长度的色谱柱后，彼此分离开来，最后按顺序流出色谱柱而进入信号检测器，在记录仪上或色谱数据机上显示出各组分的色谱行为和谱峰数值。测定各组分在色谱图上的保留时间（或保留距离），可直接进行组分的定性；测量各峰的峰面积，即可作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定相应组分的含量。

液相色谱仪工作原理图

高效液相色谱仪是实现液相色谱分离分析过程的装置，如上图所示。贮液器中存贮的载液（用作流动相的液体常需除气）经过过滤后由高压泵输送到色谱柱入口（当采用梯度洗脱时，一般需用双泵系统来完成输送）。样品由进样器注入载液系统，而后送到色谱柱进行分离。分离后的组分由检测器检测，输出信号供给记录仪或数据处理装置。如果需收集馏分作进一步分析，则在色谱柱出口将样品馏分收集起来，对于非破坏型检测器，可直接收集通过检测器后的流出液。其中输液泵，色谱柱及检测器是仪器的关键部件。

三、仪器与试剂 1．仪器

1）液相色谱仪(岛津公司) 2） 微量注射器、容量瓶等 2．试剂

甲醇（色谱纯）、二次蒸馏水、胡萝卜素、异丙醇、乙腈 四、实验条件

UV检测器:280nm 流动相：乙腈：醇=4:1 流速：1.0ml/min 进样量：20 μl 柱温：25

五、实验步骤

1、熟悉仪器基本构成、流动相的流路系统；熟悉仪器的基本操作

2．配制测定溶液 各取200ul胡萝卜素标准溶液及样品溶液于2ml试管中混合。 3．开启电脑及色谱仪各部分，等系统稳定后准备使用。

4．用微量注射器准确抽取20.0 μL溶液，注射入进样口。注意不要将气泡抽入针筒。在相同的色谱条件下，以内标法确定样品的浓度。

六、思考题

1．如何快速建立未知物的液相色谱方法？一般应考虑哪些主要因素？如何选择合适的色谱柱？

2．哪些条件会影响浓度测定值的准确性？ 3. 与气相色谱法比较，液相色谱法有那些优点？

HPLC操作程序 开机：

附：

检查流动相 开启检测器、柱温箱、泵LC-10AT B电源 开泵LC-10AT A电源（因为有记忆功能，自动记忆已开启的部件） 开启电脑 进入LC Solution软件 Anlysis 1 系统配置：选择所有已经开启的元件型号，进入右边的栏目后，按“确定”（或者用Auto Configuration健自动配置） 参数设置：设置pump的流速；检测器波长；柱温箱温度，设样品采集时间（Data acquisition time）;如果是时间程序就设置程序 Download 保存Method file Instrument On 待 柱温箱温度稳定后出现Ready

就可进样 Single start Data file保存按OK

关机：

柱子清洗：用100%甲醇流动20~30min, 用甲醇清洗加样器六通阀 按Instrument On关闭系统 退出LC Solution系统 关LC-10AT A电源

关其它元件电源