2013年公共营养师二级《食品分析》重点复习23

氨基酸的总量测定

蛋白质经水解或酶解可由大分子变成小的pro成分，如水解后的产物经胨，肽等最后成为氨基酸，氨基酸是构成pro最基本的物质。

水解后的pro和水解前的pro在物理特性，化学结构以及被吸收消化的程度上是很不相同的，其差别与水解的程度有密切关系，分析氨基酸的含量就可以知道水解的程度，也就可以评价食品的营养价值。

氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可直接测定出17种氨基酸(仪器价格昂贵，不能普遍使用)，对于食品来说有时有很多种氨基酸可以同时存在于一种食品中，所以需要测定总的氨基酸量，它们不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基酸中所含的氮(氨基酸态氮)的百分率表示，当然，如果食品中只含有一种氨基酸，如味精中的谷氨酸，就可以从含氮量计算出氨基酸的含量。

食品在评价蛋白质的营养价值时，除了测定pro的含量，氨基酸氮含量，还需要对各种氨基酸进行分离，鉴定，尤其对8种人体必需氨基酸进行定量定性分析。

一.单指示剂甲醛滴定法：

1原理：氨基酸具有酸，碱两重性质，因为氨基酸含有-COOH基，而-COOH基显示酸性，又含有-NH2，-NH2则显示碱性，由于 -COOH基和-NH2的相互作用，使氨基酸成为中性的内盐，当加入甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，其碱性消失，破坏内盐的存在，就可用碱来滴定 -COOH基，以间接方法测定氨基酸的量，反应式以三种形式存在。

用碱完全中和-COOH基时的PH值为8.4~9.2。

2试剂：

(1)40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，将甲醛用1N NaOH溶液中和(淡兰色)。

(2)0.1%百里酚酞乙醇溶液。(3)0.100N NaOH标准溶液。

3操作步骤：

称约含20mg左右的氨基酸→于烧杯中(如为固体样加水50ml)→加两滴指示剂→用0.1N NaOH溶液滴定到淡兰色→加中性甲醛20ml→摇匀→静置1分钟→此时兰色应消失→再用0.1N NaOH溶液滴定淡兰色，记录两次滴定所消耗的碱液毫升数。

计算：氨基酸态氮=(N×V×0.014×100)/W×100

二.双指示剂甲醛滴定法

1原理：

与单色法相同，只是在此法中使用了两种指示剂，从分析结果看，双指示剂甲醛滴定法与亚硝酸氮气容量法(此法操作复杂，但准确，不作介绍)相近，单色滴定法稍偏低，主要因为单指示剂甲醛滴定法是以氨基酸溶液的PH值作为中性红的终点，PH值为7.0，从理论计算看，双色滴定法比单色滴定法准确。

2试剂：同单指示剂一样，多一个0.1%中性红(50%乙醇溶液)

3操作步骤：

取相同两份样品→分别于100ml三角瓶→一份加中性红2滴→用0.1N NaOH滴定终点(由红变琥珀色)，记录用量，另一份加百里酚酞乙醇液3滴加中性甲醛20ml→摇匀→用0.1N NaOH 滴至淡兰色。

计算：

氨基酸态氮=(N×(V2-V1)×0.014×100)/W×100

V1——用中性红为指示剂时，碱液所消耗的体积

V2——用百里酚酞乙醇液为指示剂时标液消耗量

0.014——氮的毫克当量浓度

注意事项：

(1)单色指示剂甲醛滴定法，用碱完全中和—COOH基时的pH为8.5—9.5

(2)测定样品的颜色较深，应加活性炭脱色之后再滴定

三.茚三酮比色法：

1原理：氨基酸在一定pH范围内，能与茚三酮生成兰紫色化合物。可以用比色法定量测定。

2试剂：

(1)磷酸缓冲液(pH.8.04)制备方法如下：

称磷酸二氢钾4.5350g。定容500ml

称NAH2PO4·12H2O 11.9380g分别溶解定容500ml

取磷酸二氢钾10ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液

(2)2%茚三酮溶液：

称茚三酮1g→溶于35ml热水→加入40mg氯化亚锡(SnCl2·H2O)搅拌过滤(作防腐剂)→于冷暗处过夜→定容50ml

① 氨基酸标液

称干燥氨基酸(如异亮氨酸)0.2000g→溶解定容100ml→摇匀→吸10ml于另外100ml容量瓶

定容100ml，即得200Ug/ml标液

3操作方法：

(1)绘制标准曲线：

取7个25ml容量瓶，吸取标液 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0ml于7个25ml容量瓶，加水补充至容积为4ml，然后加茚三酮和缓冲液各1ml，于水浴加热15分钟，冷却后定容25ml，静置15分钟，在 570nm下测消光值，绘制标准曲线。

(2)样品测定：

取样品5.00~10.0g(液体样 5-10ml)→于烧杯中→加50ml水和活性碳约5g→加热过滤→用30—40ml热水洗涤活性炭→吸澄清样液1~4ml→加茚三酮和缓冲液各1ml水浴加热15分钟，冷却定容，静置15分钟于570nm下测定消光值，按下式计算氨基酸含量。

氨基酸含量(毫克/100克)=C/(W×1000)×100

C——从标准曲线上查得得氨基酸的量(Ug)

W——测定得样品溶液相当于样品的量(g)

注意事项：

茚三酮受阳光、温度、湿度、空气等影响易被氧化呈淡红或深红色，使用前要进行纯化，方法如下：取10g茚三酮容于40ml热水中，加一克活性炭，摇匀静置30分钟，过滤，将滤液放入冰箱中过滤，即出现兰色结晶，过滤，用2ml冷水洗涤结晶，置干燥皿中干燥，装瓶备用。