包涵体蛋白复性的几种方法

生物技术通报

技术与方法

BI ECH NoLOGY BU OT LLET N I

20 0 7年第 5期

包涵体蛋白复性的几种方法罗惠霞李敏王玉炯(夏大学生命科学学院，宁银川 7 02 ) 5 0 1

摘要：外源基因在大肠杆菌中高水平表达时，常会形成无活性的蛋白聚集体即包涵体。包涵体富含表达的重组 通蛋白，离、经分变性溶解后须再经过一个合适的复性过程实现变性蛋白的重折叠，够得到生物活性蛋白。才能关键词：包涵体 复性

Re o d ng o n l so Bo y f l i f I c u i n dL o H i a L n W agY jn u ux i i Mi n uo g( oeeo eSi c i x n e , i ha 50 1 C/g fZ c neN n i U i r Yn un702 )/ f i e ga vs cA s c: W hnetmi gnshgl epe nEceci clic s n b a ( at epo i ag gt nwl bt t a r e x i c ee i y x rsi s r ha o, l i oy i cv rt gr ao ) i r h s h i i uo n n i e n e i lb fr dIc in o y o tis mu h x rsin eo ia o rt rTh n rti wi bo cii wi b g t e ome . l o b d c nan c e es rc mbn t n p oe￣ e poe nu s p o i i n t iat t h v y l e o ltr u h spaain,e trto dsou o a r p r rf li . h o g e rto d n u a n i lt n,nd p o e eodng a i s i

K ywo d o r s: I c i n b d Reo d g nl o o y s u fln i

1包涵体形成的原因重组蛋白在宿主系统中高水平表达时。论是无用原核表达体系或酵母表达体系甚至高等真核表

解；于生产那些处于天然构象时对宿主细胞有毒对害的蛋白时，涵体形成无疑是最佳选择。包

2包涵体的分离及溶解包涵体是聚集的蛋白质形成的非常致密的颗

达体系，可形成包涵体。事实上，都内源性的蛋白质，果表达水平过高，会聚集形成包涵体。因如也 此，包涵体形成的

原因主要是高水平表达的结果。 动力学模型表日 活性蛋白的产率取决于蛋白合月【:】成的速率、白折叠的速率和蛋白聚集的速率。在蛋高水平表达时，生肽链的聚集速率一旦超过蛋白新 正确折叠的速率就会导致包涵体的形成。实验证明。氧还蛋白还原酶活性缺失突变的大肠杆菌菌硫

粒，们可直接用反相显微镜在活细胞中观察到聊。它 包涵体的分离包涵体分离的第一步是对培养收集的重组菌细胞进行破碎，采用的破碎技术包括高所压匀浆、声波破碎等，了提高破碎率，以加入超为可一

定量的溶菌酶。包涵体高度抗剪切力，以上破用

碎法破碎后仍可保持完整的结构。心除去破碎上离清液后的沉淀部分用含有低浓度的变性剂如脲和

株 A A 9, D 4 4 D 3等有利于二硫键在细胞 D 44 A A 9 ( E )质内的形成【 2】组蛋白在大肠杆菌中表达时。。重缺乏一

盐酸胍、去垢剂如 t )10脱氧胆酸钠等化合物 o (0、 n的缓冲液进行洗涤I。包涵体的溶解一般都用强的 4 1变性剂如脲、酸胍或硫氰酸盐，去垢剂如 S S 盐或 D、正十六烷基三甲基铵氯化物、于含有半胱氨酸的对

些蛋白折叠过程中需要的酶和辅助因子。如折叠

酶和分子伴侣等，包涵体形成的又一原因。包涵是体虽然由无活性的蛋白组成。包涵体形成对于重但组蛋白的生产也提供了几个优势：涵体具有高密包度，于分离纯化；蛋白以包涵体的形式存在有易组效地抵御了大肠杆菌中的蛋白酶对目的蛋白的降收稿日期：070 .9 20 -40基金项目：夏自然科学基金资助 (目号： Z 5 5宁项 N 00 )作者简介：惠霞 (9 6)女，子生物与生物化学硕士研究生罗 17 -,分通讯作者：王玉炯，,男教授，— alw j ueuc E m i yC . .:￣x d n

蛋白质。需加人还原剂如巯基乙醇、硫赤藓糖还二醇和半胱氨酸。温度一般选择在 3℃以促进溶解。 0 此外，由于金属离子具有氧化催化作用，常常需还

要加人金属螯合剂如 E T E 1以除去金属离 D A、 G l A

20 0 7年第 5期

罗惠霞等：包

涵体蛋白复性的几种方法剂或表面活性剂：如 C A s Ti n O、磷脂、 H P、 roXl0 t

子。对于细胞周质内形成的包涵体，需采用原位则

溶解的方法【。各种溶解方法都各有利弊，般来 一讲，酸胍优于脲，盐因为盐酸胍是较脲强的变性剂，而且脲中常含有的异氰酸盐或酯会不可逆地修饰蛋白质的氨基或巯基[。 6 1

l rl h s、 a oy、基甜菜碱 ( D B等对蛋 a ya oi Sr sl磺 u m d k N S)白质复性有促进作用[。使用去垢剂和表面活性剂 9 1的一个不利之处是由于它们能与蛋白质结合或形成胶束，很难将它们完全除去。( )克隆抗体：故 5单待折叠复性的蛋白质的抗体可有效协助其复性 .但仅该蛋白质特异的抗体具有明显的助折叠作用[。 1 O l研究发现，异性抗体可以与待折叠蛋白的远离蛋特

3包涵体蛋白的复性31复性机制 .

自 15 9 9年 K ue am首次提出“ a zw n疏水作用” 以来.人们采取多种手段及方法研究疏水作用与蛋白 质折叠之间的关系。由于生物体内的蛋白质处于水

白质活性中心的疏水区结合 .而有效地阻止了无从活性聚集体形成。 6分子伴侣和折叠酶等： ()这类蛋白质主要包括硫氧还蛋白、硫键异构酶 ( D )肽二 P I、

相环境中 .白质亲水基团暴露在外侧，疏水基蛋而团出于避开水的需要而被迫接近被包埋的蛋白质

酰脯氨酰顺反异构酶 ( P )分子伴侣、 K 0 P I、 F 5 6结合蛋白等。子伴侣和折叠酶等不仅可在细胞内调节分蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质的折叠复性。由于分子伴侣和折叠酶在蛋白质折叠复性后要除去，而这类蛋白质又十分昂 贵，因此采用可回收利用的方法如固定化方法为好。( )工伴侣：了模仿分子伴侣 G o LG o S 7人为 r rE E的作用， oe a和 G l a t1变性蛋白质首先加 R zm el n“ m将入到含去垢剂的溶液中以防止聚集，后用环糊精然 cc dxr y l etn除去去垢剂以促进折叠复性 .种方法 o i这

立体结构内部。此时 .白质

结构可以看作为亲水蛋疏水作用之间的平衡。32复性技术及方法 .

( )化——还原转换系统：蛋白质含有二 1氧如

硫键，复性缓冲液中需加入还原型及氧化型低分在子质量巯基试剂的混合物 .如谷胱甘肽、胱氨酸、半 半胱胺等。其还原型 (~ m o L与氧化型的摩尔 13 m l )/比为 1 1到 1:t。: O I1这样的氧化还原系统实际上给

蛋白质形成的是一个还原环境。确形成的二硫键正在这样的环境中还是有可能被还原的。针对这种情况，还需在后续步骤加入一步强的氧化步骤 .即加入过量的氧化型巯基试剂或采用 C 2导的空气 u诱

被称作人工分子伴侣促折叠技术。 8稀释复性： ()稀释变性蛋白质溶液、低变性剂浓度 .而为蛋白降从

质折叠创造适宜的外部环境，一种最简单、是是也传统的蛋白质复性方法。蛋白质折叠为分子内反应，一级反应过程 .聚集体的生成为二级以上为而

氧化，以保证形成稳定的二硫键。 2小分子质量添 ()

加剂：盐酸胍或脲，及其他一些化合物如烷基如以

脲、酸酰胺类等 .碳在非变性浓度下是很有效的促进剂。蛋白质的辅因子、配基或底物亦可起到很好的促折叠作用，蛋白质的辅因子 Z 2 C 2以如 n+或 u+可

的反应过程。所以 .蛋白质浓度有利于获得较高低的复性收率。因此，目前蛋白质复性的浓度均较低。 尽管在低浓度条件下多数蛋白质可获得较高的复性收率，是降低蛋白质浓度势必增大蛋白质溶液但体积，给后续的分离纯化增加困难。因此，在提高蛋白质复性收率的同时必须设法增大蛋白质浓度。 ()性色谱： 9复复性色谱作为蛋白质分离纯化的重要手段，色谱技术对蛋白质复性的作用近年来得到了广泛的认识，中引人注目的 …… 此处隐藏：2398字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……