阿司匹林对胃癌细胞增殖和核因子κB表达的影响(3)

二氧化碳培养箱：ＲＣ０３０００Ｔ００５．ＶＢＣＯｍｅｒｍｏ）

超净工作台：ＳＷ－ＣＪ－２Ｆ（苏州安泰空气技术有限公司）

高速冷冻离心机：Ｍｅｇａｆｕｇｅ１．０Ｒ（ＨＥＲＡＥＵＳ）

电泳仪：Ｊｉｍ—Ｘ（Ｂｉｏ．Ｒａｄ）

荧光显微镜：ＤＦＣ３００ＦＸ（Ｌｅｉｃａ）

凝胶成像及分析系统：ＳＹＮＧＥＮＥ（ＧＥＮＥ）

空气浴摇床：ＴＨ．１５（ＪＯＵＡＮＡＮＯＴＴＯ）

电子天平：北京赛多利斯仪器有限公司

电热恒温干燥箱：ＥＣＯＣＥＬＬ

超声波破碎仪：ＸＬ２０２０

超纯水分离系统：ＰＬ５２４３（ＰＡＬＵ

超低温冰箱：ＵＬＴ．７９０．３Ｖ（Ｔｈｅｒｍｏ）

Ｔｙｐｈｏｏｎ扫描仪：Ｔｙｈｈｏｏｎ９４００（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）

酶标检测仪：６８０（Ｂｉｏ．Ｒａｄ）

阿司匹林对胃癌细胞增殖和核因子κB表达的影响

江苏大学项士学位论文

第三章实验方法及步骤

３．１细胞培养

人胃癌细胞株ＳＧＣ．７９０１，ＡＧＳ，ＢＧＣ０８２３用含１０％小牛血清的ＤＭＥＭ培养液，置于３７＂Ｃ、饱和湿度、５％Ｃ０２的Ｃ０２培养箱中培养。待细胞铺满瓶底后，用０．２５％胰蛋白酶（用１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡＮａ２配制）消化成单细胞，传代培养，取对数生长期的细胞进行实验。

３．２ＭＴＴ法检测阿司匹林对ＳＧＣ－７９０１，ＡＧＳ，ＢＧＣ－８２３增殖的影响

取对数生长期的ＳＧＣ．７９０１，ＡＧＳ，ＢＧＣ．８２３细胞，用０．２５％的胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，用细胞计数板记数，调整细胞密度为４ｘ１０４／ｍＬ，接种于９６孔培养板上，每孔２０吮Ｌ（每孔８晰细胞），取不含细胞的培养液作空白调零。将９６孔板置于３７＂（２、５％Ｃ０２的Ｃ０２培养箱中培养２４ｈ后，各孔分别加入终浓度为０．１ｍｍｏｌ／Ｌ，１ｍｍｏｌ／Ｌ，５ｍｍｏｌ／Ｌ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ的阿司匹林溶液，以不含阿司匹林的培养液作为阴性对照，各组设３个复孔。分别培养２４ｈ，４８ｈ，７２ｈ后，各孔加入０．５％的ＭＴＴ２０ｐＬ，继续培养４ｈ，吸除孔内液体，各孔加入１５叽ＬＤＭＳＯ，震荡１０ｍｉｎ后，用酶标仪在５７０ｎｍ波长处测光密度值（Ｄ值），并计算阿司匹林对ＳＧＣ．７９０１，ＡＧＳ，ＢＧＣ．８２３细胞的抑制率，抑制率＝（１．实验组光密度均面对照组光密度均值）ｘ１００％。该实验重复三次。

３．３ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡

３．３．１总ＤＮＡ提取

取对数生长期的ＳＧＣ．７９０１，ＡＧＳ，ＢＧＣ．８２３细胞制成单细胞悬液，接种于培养瓶内，待细胞长满瓶底，换无血清培养液继续培养１２ｈ，各瓶加入终浓度为１０ｍｍｏｌ／Ｌ的阿司匹林溶液，分别作用６ｈ，１２ｈ，２４ｈ，以不含阿司匹林的培养液作为阴性对照。离心收集上清液中和贴壁细胞至１．５ｍＬ的ＥＰ管中，加入４００ｐＬＤＮＡ提取缓冲液，跏Ｌ蛋白酶Ｋ（终浓度为４００ｐｇ／ｍＬ），混匀后在５５－－－６５＂Ｃ水浴锅中放置２ｈ。加入３０毗Ｌ６ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣＩ，剧烈震荡３０秒，混匀后于４＂Ｃ、１００００９９

阿司匹林对胃癌细胞增殖和核因子κB表达的影响

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离一１二，３０ｍｉｎ，将上清移至另－－ＥＰ管中，加入等体积的异丙醇，混匀，．２０。Ｃ放置１ｈ后，４℃、１００００９离一１二，１５ｍｉｎ，弃上清，用７０％的乙醇洗涤沉淀，待沉淀干燥后将其溶于适量的灭菌水中，样品置于．２０℃保存备用。

３．３．２ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳

配制１％的琼脂糖溶液，待其冷却至６０＂Ｃ左右时加入１０ｍ咖ｌＥＢ靴Ｌ，充分混匀，将温热的凝胶倒入己置好梳子的电泳板中，倒胶时应缓慢避免产生气泡。在室温下放置待其凝固，取出梳子，将电泳板移入电泳槽内，加入ｌｘＴＡＥ至覆盖凝胶面。取ＩＯ肛ＬＤＮＡ样品，加入１／ｔＬ

恒压８０Ｖ电泳１ｈ，紫外灯下观察结果。Ｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ，混匀后加到各加样孔中。

３．４流式细胞术检测阿司匹林对细胞周期的影响

将ＳＧＣ．７９０１，ＡＧＳ，ＢＧＣ．８２３细胞分别接种在三块６孔板内，待细胞长满板底后各孔内分别加入终浓度为０．１ｍｍｏｌ／Ｌ，１ｍｍｏｌ／Ｌ，５ｍｍｏｌ／Ｌ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ的阿司匹林溶液，共培养２４ｈ。用０．２５％的胰蛋白酶消化后收集细胞，细胞用ＰＢＳ洗涤两次，１０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ离心沉淀。加入４℃预冷的７０％乙醇，混匀，４℃过夜。１５００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，去除乙醇。ＰＢＳ洗涤两次，１０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ离心沉淀。上机检测前加入４０印ＬＰＢＳ重悬细胞，加入终浓度为５吮∥ｍＬ的ＲＮａｓｅ和碘化丙啶（ＰＩ），常温下避光染３０ｍｉｎ，上流式细胞仪进行细胞周期分析。

３．５ＷｅｓｔｅｒｎｂＩｏｔｔｉｎｇ法检测阿司匹林对ＮＦ－ＫＢｐ６５表达的影响３．５．１核蛋白的提取

将ＳＧＣ．７９０１，ＡＧＳ，ＢＧＣ．８２３细胞分别接种在６：ＩＬ板内，待细胞长满板底后各孔内分别加入终浓度为０．１ｍｍｏｌ／Ｌ，１ｍｍｏｌ／Ｌ，５ｍｍｏｌ／Ｌ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ的阿司匹林溶液，以不含阿司匹林的培养液作为阴性对照，作用２４ｈ：另将三种细胞接种于６孔板后，用１０ｍｍｏｌ／Ｌ的阿司匹林分别作用６ｈ，１２ｈ，２４ｈ，同样以不含阿司匹林的培养液作为阴性对照。吸除培养液，用预冷的ＰＢＳ洗两次，将细胞刮下移至１．５ｍＬ的ＥＰ管中，４℃离一Ｃ，５ｍｉｎ收集细胞。各管中分别加ＡＩＯＯ／ｚＬ自制的细胞裂解液ＢｕｆｆｅｒＡ（使用前加ＤＴＴ和磷酸酶抑制剂），振荡混匀后在冰盒内放置１０ｍｉｎ，加入４／ｔＬＮＰ．４０，振荡混匀后冰盒内放置５ｍｉｎ，４℃、１２０００９离一Ｃ，１０ｍｉｎ，吸除上清，在沉淀中加入５毗Ｌ自制的细胞裂解液ＢｕｆｆｅｒＢ（使用前加入磷酸酶抑制剂１，振荡混匀后在冰盒内放置３０ｍｉｎ，每隔１０ｍｉｎ振荡混匀一次，共３次。４℃、

阿司匹林对胃癌细胞增殖和核因子κB表达的影响

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１２０００９离，５ｑｏｍｉｎ，上清即为胞核蛋白。取４０／ｚＬ＿］：：清，））【ｌＹｋ．４０９Ｌ２ｘＬｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ，混匀后在沸水中煮５ｒａｉｎ，样品放．２０℃保存备用。

３．５．２ＷｅｓｔｅｒｎｂＩｏｔｔｊｎｇ法

（１）配胶及灌胶：配制１０％的分离胶，混匀后加入到凝胶板中，灌至玻板高度的２／３即可，用０．１％的ＳＤＳ封闭压线，待胶凝固后倒去上层的ＳＤＳ，用滤纸吸干残留的ＳＤＳ，注入配好的成层胶，直至灌满，插入梳子。在室温下放置２０ｍｉｎ至３０ｍｉｎ，胶凝固后拔去梳子。

（２）电泳：将配好的凝胶放入电泳槽，倒入电泳缓冲液。每孔加入１吮Ｌ蛋白样品，样品两侧加入空白的２ｘＬｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ。上样后，成层胶中以恒压８０Ｖ来积聚蛋白，当蛋白进入分离胶后，以恒压ｌＯＯＶ电泳１．５ｈ使蛋白分离。

（３）转膜：电泳结束后，将凝胶上的蛋白转至ＰＶＤＦ膜上。ＰＶＤＦ膜应预先用甲醇浸泡１５ｓｅｃ，再放入转膜缓冲液中浸泡５ｒａｉｎ以上。转膜时从阴极至阳极放置的顺序依次为：海绵、滤纸、凝胶、ＰＶＤＦ膜、滤纸、海绵，同时应注意赶尽胶与膜之间的气泡。 …… 此处隐藏：1410字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……