阿司匹林对胃癌细胞增殖和核因子κB表达的影响(2)

过去十几年人们对阿司匹林抗肿瘤效应的研究主要集中在环氧合酶（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ，ｃｏｘ）依赖的途径。研究显示，阿司匹林通过抑制ＣＯＸ活性而发挥抗肿瘤效应。ＣＯＸ是前列腺素（ＰＧ）合成过程中的限速酶，催化花生四烯酸（ＡＡ）生成一系列内源性前列腺素，进而维持机体的各种生理功能和病理过程。ＣＯＸ有两种同工酶：ＣＯＸ．１和ＣＯＸ．２，两者有不同的生物学机制。ＣＯＸ．１被称为结构性同工酶，存在于体内大多数细胞的内质网中且持续表达，主要调节生理性ＰＧ的合成，与维持细胞的自稳状态有关。ＣＯＸ．２被称为诱导性同工酶，在正常组织中表达水平很低，几乎检测不到，而在炎症，肿瘤等病理状态下呈高表达。人的ＣＯＸ．２基因定位于１号染色体的ｌｑ２５．２＂＇２５．３，含１０个外显子和９个内含子，基因长度约８．３Ｋｂ，其５’端转录起始点长０．８Ｋｂ，此区含ＮＦ．ＫＢ的结合位点，它与ＣＯＸ．２的表达调控有关。Ａｋｈｔａｒ等【７ｌ认为，ＣＯＸ．２启动子通过去甲基化促进ＣＯＸ．２表达。国内外相关研究表明，ＣＯＸ．２在许多恶性肿瘤组织中高度

阿司匹林对胃癌细胞增殖和核因子κB表达的影响

江苏大学硕士学位论文

表达Ｉ舡１伽，在胃肠道肿瘤中的表达尤其显著【１ｌ】。胃癌组织较邻近的正常胃黏膜上皮能产生更多的ＰＧｓ，提示ＣＯＸ．２与胃癌的发生密切相关。研究【１２ｄ６ｌ发现，ＣＯＸ．２与实体肿瘤的血管生成以及转移性有关，ＣＯＸ．２过度表达可促进肿瘤血管的生成，抑制肿瘤细胞凋亡，增加肿瘤转移潜力和抑制免疫监视功能。目前研究认为阿司匹林能抑制ＣＯＸ．２活性，下调ＣＯＸ．２的表达，通过抑制ＣＯＸ．２自身作用或抑制ＰＧＥ２的合成而发挥抗肿瘤效应。其具体机制可能为：抑制肿瘤细胞ＤＮＡ合成和增殖周期；促进免疫监视，促进抗体生成；抑制ｂｃｌ．２表达，促进细胞凋亡；抑制肿瘤血管生成；抑制肿瘤细胞侵袭转移。

虽然ＮＳＡＩＤｓ调节肿瘤细胞增殖及诱导其凋亡与抑制ＣＯＸ．２有关，但对ＣＯＸ．２活性的抑制仅是其作用机制的一部分。Ｇｒｏｓｃｈ等【１７ｌ报道，ＮＳＡＩＤｓ可降低结肠癌细胞增殖率，改变细胞周期分布，诱导细胞凋亡，而不论其细胞ＣＯＸ一２表达水平，提示阿司匹林也可能通过其它途径发挥抑制肿瘤的作用。最近的研究显示，５＂－ＩＮ匹林的抗肿瘤效应并不局限于对ＣＯＸ．２的抑制作用１１８ｄ９１，还可能涉及到细胞内多条信号传导通路，核转录因子（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｋａｐｐａＢ，ＮＦ－ｒ．Ｂ）途径便是目前的研究热点。Ｋｏｐｐ和Ｇｈｏｓｈ于１９９４年发现了阿司匹林和水杨酸盐对重要的核转录因子具有抑制作用【冽。这一发现使得人们开始从转录因子的角度去研究阿司匹林抑制肿瘤增殖的机制。研究证实，ＮＦ．ｒ．Ｂ在肿瘤生长过程的信息传递中起重要作用，与肿瘤的发生发展、浸润转移密切相关１２１１。诸多研究表明，ＮＦ．ＫＢ与肿瘤细胞凋亡具有十分密切的关系。ＮＦ．１ｃＢ具有抑制细胞凋亡作用是在对ＲｅｌＡ－／－ｄ、鼠模型的研究中首先被发现的。实验中发现剔除ＲｅｌＡ基因的胎鼠发育到妊娠中期时死于大片肝细胞的凋亡１２２ｌ，其机制是通过肿瘤坏死因子受体ｌ（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉＳｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ１，ＴＮＦＲｌ）介导的１２３１。ＮＦ．１（Ｂ抗细胞

与ＩＡＰｓ家族、Ｂｃｌ．２家族、ＴＲＡＦ

其具体机制尚未凋亡是一个涉及多个信号通路的复杂过程，家族、ＪＮＫ、ＦＬＩＰ、Ａ２０、Ｇａｄｄ４５ｂ、ＭｎＳＯＤ等有很大关系，

完全清楚，但其主要方式是通过诱导或上调抗凋亡基因的表达实现的。近年来的研究表明，ＮＦ—ｒ，Ｂ通过调控各种靶基因转录，抑制胃癌细胞凋亡，在胃癌的发生、发展、转移中具有重要作用。因此，将ＮＦ．ＫＢ作为肿瘤治疗的新靶点，对其活性进行选择性调控，为包括胃癌在内的肿瘤治疗开辟了一条新途径。１．２本论文研究的目的、意义、方法、实验方案的设计

阿司匹林对胃癌细胞增殖和核因子κB表达的影响

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１．２．１研究目的：

探讨阿司匹林对不同胃癌细胞株增殖的影响及其对核因子～１ｃＢｐ６５（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ－ｒ．Ｂｐ６５，ＮＦ－ｒ．Ｂｐ６５）表达的影响。

１．２．２研究内容：

采用ＭＴｒ法检测阿司匹林对胃癌细胞株ＳＧＣ．７９０１，ＡＧＳ，ＢＧＣ．８２３增殖的抑制作用；采用ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳检测阿司匹林作用后的细胞凋亡：用流式细胞术检测不同浓度阿司匹林对细胞周期的影响；通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ法和免疫荧光法检测阿司匹林对胃癌细胞ＮＦ－ｒ，Ｂｐ６５表达的影响。

１．２．３研究意义：

通过研究阿司匹林对胃癌细胞株增殖的影响及其对ＮＦ－ｒ，Ｂｐ６５表达的影响，初步阐明阿司匹林对胃癌细胞的抑制作用，为探索新的有效的化学预防手段提供理论依据，并将ＮＦ．１ｃＢ作为肿瘤治疗的新靶点，为包括胃癌在内的肿瘤治疗开辟新的途径。

１．２。４研究方法：

ＭＴＴ法，ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳，流式细胞术，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ法和免疫荧光法。

１．２．５实验方案设计：本论文实验方案的操作路线如下：

阿司匹林对胃癌细胞增殖和核因子κB表达的影响

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甲

阿司匹林对胃癌细胞增殖和核因子κB表达的影响

第二章实验材料和仪器

２．１材料和试剂

（１）细胞株：人胃癌细胞株ＳＧＣ－７９０１，ＡＧＳ，ＢＧＣ．８２３由上海细胞生物所提供。

（２）试剂：小牛血清购白兰州民海生物工程公司；低糖ＤＭＥＭ与ＭＴｒ购自Ｇｉｂｃｏ公司：胰蛋白酶，阿司匹林粉剂，二甲亚砜（ＤＭＳＯ），碘化丙啶（Ｐ１）购自Ｓｉｇｍａ公司；发光剂（ＥＣＬ－ｐｌｕｓ）购自ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ公司；兔ＮＦ－ｒＢｐ６５多克隆抗体购自碧云天生物技术研究所；山羊抗兔的二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；ＦＩＴＣａｎｔｉ．ｒａｂｂｉｔＩｇＧ购自ＳａｎｔａＣｒｕｚｅ公司；

２．２主要溶液的配制

磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）：８９Ｎａｃｌ，０．２９ＫＣＩ，１．５６９Ｎａ２ＨＰ０４．Ｈ２０，０．２９ＫＨ２Ｐ０４溶解于１ＬｄｄＨ２０中。

０．５％Ｍ＇ＩＴ溶液：２５ｍｇＭＴＦ粉溶于５ｍｌＰＢＳ液中，振荡搅拌至完全溶解，针式滤器抽滤除茵，封口后放至４＂Ｃ冰箱备用。两周内有效。

ｌＯｍｍｏｌ／Ｌ阿司匹林储存液：３６．０４ｍｇ阿司匹林粉剂溶于２０ｒａｌ无血清培养液中，搅拌至完全溶解，针式滤器抽滤除菌，封口后至．２０℃冰箱保存备用。

３０％丙烯酰胺：２９９丙烯酰胺和ｌｇＮ，Ｎ’．亚甲双丙烯酰胺溶于１００ｍｌ

中，过滤备用。

Ｔｒｉｓ—ＨＣ！（ｐＨ８．８）：１８．２９ｄｄＨ２０Ｔｒｉｓ碱溶于１００ｍｌｄｄＨ２０中，浓盐酸调ｐＨ。

ｄｄＨ２０中，浓盐酸调ｐＨ。Ｔｒｉｓ ＨＣ！（ｐＨ６．８）：６．０５９Ｔｒｉｓ碱溶于１００ｍｌ

５ｘＴｒｉｓ－甘氨酸电泳缓冲液：１５．１９Ｔｒｉｓ碱和９４９甘氨酸溶于９５０ｍｌｄｄＨ２０中，再加入５０ｍｌ１０％的ＳＤＳ贮存液（ｗ／ｖ）。

２×ＳＤＳ－ＰＡＧＥＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ： …… 此处隐藏：1708字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……