《化妆品微生物标准检验方法》GB 7918.1～5——87(2)

注：蛋白胨应含有丰富的色氨酸，每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。 4.5 革兰氏染色液： 4.5.1 染液制备 4.5.1.1 结晶紫染色液： 结晶紫 95%乙醇 1%草酸铵水溶液 4.5.1.2 革兰氏碘液： 碘 碘化钾 蒸馏水加至 300mL。

4.5.1.3 脱色液：95%乙醇。 4.5.1.4 复染液： a. 沙黄复染液： 沙黄 95%乙醇 蒸馏水

将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。

b. 稀石碳酸复红液：称取碱性复红10g，研细，加95%乙醇100mL，放置过夜，滤纸过滤。取该液10mL，加5%石碳酸水溶液90mL混合，即为石碳酸复红液。再取此液10mL加水90mL，即为稀石碳酸复红液。

20g 5g 1000mL

制法：将上述成分加热融化，调pH值为7.0～7.2，分装小试管，103.43kPa(15 lb)15min

1g 20mL 80mL

将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。

1g 2g 300mL

将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至

0.25g 10mL 90mL

4.5.2 染色法

4.5.2.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。 4.5.2.2 滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。

4.5.2.3 滴加95%乙醇脱色，约30s，或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s，水洗。

4.5.2.4 滴加复染液，复染1min，水洗，待干，镜检。 4.5.3 染色结果

革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

注：如用1:10稀释石碳酸复红染色液作复染，复染时间仅需10s。

5 操作步骤

5.1 取10mL 1:10稀释的检液，加到10mL双倍浓度的乳糖胆盐培养基中，置44℃±0.5℃培养箱中培养24h～48h，如不产酸也不产气，则报告为粪大肠菌群阴性。

5.2 如产酸产气，划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置37℃培养18 h～24 h。同时取该培养液1～2滴接种到蛋白胨水中，置44℃±0.5℃培养24h。

经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长。粪大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落，亦常为粪大肠菌群，应注意挑选。 5.3 挑取上述可疑菌落，涂片作革兰氏染色镜检。

5.4 在蛋白胨水培养液中，加入靛基质试剂约0.5mL，观察靛基质反应。阳性者液面呈玫瑰红色；阴性反应液面呈试剂本色。

6 检验结果报告

根据发酵乳糖产酸产气，平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。

四、绿脓杆菌

Pseudomonas Aeruginosa

1 范围

本规范规定了化妆品中绿脓杆菌的检验方法。 本规范适用于化妆品中绿脓杆菌的检验。 2 定义

本规范采用下列定义。

绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)属于假单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在42℃条件下能生长。 该菌对人有致病力，可使伤处化脓，引起败血症等。 3 仪器

3.1 恒温培养箱：37℃、42℃。 3.2 三角瓶。 3.3 试管。 3.4 平皿。

3.5 刻度吸管：10mL、2mL、1mL。 3.6 显微镜。 3.7 载玻片。 3.8 接种针、接种环。 3.9 电炉。 3.10 高压灭茵器。

4 培养基和试剂 4.1 SCDLP液体培养基 见总则中3.2。

4.2 十六烷基三甲基溴化铵培养基 成分： 牛肉膏 蛋白胨 氯化钠

十六烷基三甲基溴化铵 琼脂 蒸馏水

lb)20min灭菌后，制成平板备用。 4.3 乙酰胺培养基 成分： 乙酰胺 氯化钠 无水磷酸氢二钾

10g 5g 1.39g 3g 10g 5g 0.3g 20g 1000mL

制法：除琼脂外，将上述成分混合加热溶解，调pH为7.4～7.6，加入琼脂，68.95kPa (10

无水磷酸二氢钾 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 琼脂 蒸馏水

0.73g 0.5g 20g 1000mL

酚红 0.012g（1.2%溶液1mL）

制法：除琼脂和酚红外，将其它成分加到蒸馏水中，加热溶解，调pH为7.2，加入琼脂、酚红，103.43kPa(15 lb)20min高压灭菌后，制成平板备用。 4.4 绿脓菌素测定用培养基 成分： 蛋白胨 氯化镁 硫酸钾 琼脂 甘油(化学纯) 蒸馏水

20g 1.4g 10g 18g 10g 1000mL

制法：将蛋白胨、氯化镁和硫酸钾加到蒸馏水中，加温使其溶解，调pH至7.4，加入琼脂和甘油，加热溶解，分装于试管内，68.95kPa(10 lb)20min高压灭菌后，制成斜面备用。 4.5 明胶培养基 成分： 牛肉膏 蛋白胨 明胶 蒸馏水

3g 5g 120g 1000mL

制法：取各成分加到蒸馏水中浸泡20min，随时搅拌加温使之溶解，调pH至7.4，分装于试管内，经68.95kPa(10 lb)20min灭菌后，直立制成高层备用。 4.6 硝酸盐蛋白胨水培养基 成分： 蛋白胨 酵母浸膏 硝酸钾 亚硝酸钠 蒸馏水

10g 3g 2g 0.5g 1000mL

制法：将蛋白胨和酵母浸膏加到蒸馏水中，加热使之溶解，调pH为7.2，煮沸过滤后补足液量，加入硝酸钾和亚硝酸钠，溶解混匀，分装到加有小倒管的试管中，68.95kPa(10 lb)20min灭菌后备用。

4.7 普通琼脂斜面培养基 成分： 蛋白胨 牛肉膏 氯化钠 琼脂 蒸馏水

10g 3g 5g

15g 1000mL

制法：除琼脂外，将其余成分溶解于蒸馏水中，调pH为7.2～7.4，加入琼脂，加热溶解，分装试管，103.43kPa(15 lb)20min高压灭菌后，制成斜面备用。

5 操作步骤

5.1 增菌培养：取1:10样品稀释液10mL加到90mL SCDLP液体培养基中，置37℃培养18h～24h。如有绿脓杆菌生长，培养液表面多有一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。 5.2 分离培养：从培养液的薄膜处挑取培养物，划线接种在十六烷基三甲基溴化铵琼脂平板上，置37℃培养18h～24h。凡绿脓杆菌在此培养基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素，此培养基选择性强，大肠艾希氏菌不能生长，革兰氏阳性菌生长较差。

在缺乏十六烷基三甲基溴化铵培养基时也可用乙酰胺培养基进行分离，将菌液划线接种于平板上，放37℃培养24h，绿脓杆菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色，其它菌不生长。

5.3 染色镜检：挑取可疑的菌落，涂片，革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性者应进行氧化酶试验。

5.4 氧化酶试验：取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻璃棒挑取绿脓杆菌可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲基对苯二胺试液，在15s～30s之内，出现粉红色或紫红色时，为氧化酶试验阳性；若培养物不变色，为氧化酶试验阴性。 5.5 绿脓菌素试验：取可疑菌落2～3个，分别接种在绿脓菌素测定培养基上，置37℃培养24h，加入氯仿3mL～5mL，充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿液内，待氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管中并加入 …… 此处隐藏：2840字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……