预防兽医学复习题答案汇总-整理(4)

PB2、PB1、PA分别由片段1，2，3编码，共同组成了流感病毒的RNA聚合酶复合物，发挥RNA酶的作用，负责mRNA和vRNA的复制和转录。

注：黑体字只需在论述题答，简答题只需答非黑体字部分。

15．动物RNA病毒的反向遗传系统的建立方法有几种？每种方法各有什么优缺点？ 答：1）以T7 RNA聚合酶为基础的病毒拯救系统

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① 以表达T7RNAP的痘病毒为基础的体内拯救系统及缺点

优点：T7RNAP能够有效地促进大量RNA在体内进行转录，这些RNA都是在哺乳动物细胞的细胞质中，通过T7RNAP控制T7启动子而启动转录的。

缺点: T7RNAP痘毒株系统由于痘病毒株而引起该系统一些缺陷。痘毒株对宿主细胞有致细胞病变作用，子代痘病毒的释放同时也会干扰拯救病毒子代病毒的释放，降低了从克隆DNA中拯救病毒的效率，这也干扰对目的产物的分析。

该系统辅助病毒感染可以产生相对较快的细胞病变效应，从而也会引起病毒拯救困难。在感染细胞期间，致细胞病变效应限制了病毒拯救和在该细胞上病毒繁殖的时间期限。这使得对生长缓慢的高度致弱病毒或病毒载体进行拯救非常困难。辅助病毒的使用还会在拯救过程中引入一种生物学感染性抗原。对这类问题有严格的要求:(l)辅助病毒的起源和传代背景必须被充分的证明;(2)辅助病毒繁殖从来没有经过未知起源牛血清的处理，否则，这可能会使其有暴露于牛的海绵状脑病的危险;(3)在拯救过程中的辅助病毒使用必须严格的被检验，以确保不存在外来抗原的干扰，这些外来抗原可能是通过在牛、猪、或鸟类的衍化物质中暴露而被引入同源重组常常在全长基因组和辅助质粒之间，通过疫苗毒株的DNA聚合酶而频繁发生。

在真核中T7RNAP是否能够维持足够高的活性及建立高效的拯救系统难以保证

② T7RNAP为基础的无痘病毒的拯救系统

优点：不需要考虑子代痘病毒的释放同时也会干拯救病毒子代病毒的释放的问题。具有能够表达充足 T7RNAP的稳定细胞系，T7RNAP基因能够稳定的被整合到细胞的基因组中，并且能够在不同的靶细胞内，在没有发生变异的情况下，高水平表达。

缺点：稳定表达T7RNAP的细胞系很难建立和培养。在选择压力下进行传代，很难建立一个不缺失 T7RNAP活性的稳定细胞系。此外，该方法在疫苗研制中的应用可能会受到限制，因为用于疫苗候选株的细胞系的确认是很困难的。

要建立具有高效拯救效率的细胞系，还要注意选择合适的逆转录病毒载体，要考虑它的转录启动子的转录效率以及与宿主基因组整合的效率和拷贝数。

2）真核RNA聚合酶Ⅰ拯救系统

优点：RNA聚合酶Ⅰ转录产物5`端不加帽，3’端不加尾，故没有冗余序列。RNA聚合酶Ⅰ是细胞核内含量丰富的酶，它能转录出精确的rRNA(类似于流感病毒的vRNA)。该酶还能在特定的启动子和终止子序列处启动/终止转录，PolⅠ终止子位点高度精确。RNA聚合酶Ⅰ系统比RNP直接转染系统更为有效，因为它能进行体外转录、蛋白质纯化和体外RNP装配。其转染效率较高，原因在于293T细胞具有很高的转染效率，并且细胞中具有足够的RNA聚合酶Ⅰ和较高的转录效率，能随着细胞增殖保证RNA聚合酶工的供给。

缺点：该系统病毒产毒量特别低的缺点。由于RNA聚合酶Ⅰ转录活性具有特异性，在不同宿主和细胞里表现不同活性。

3）真核RNA聚合酶Ⅱ拯救系统

RNA聚合酶Ⅱ位于核质内，它负责合成核不均一RNA(hnRNA)，即mRNA的前体。目前商品真核载体绝大多数都是利用RNA聚合酶Ⅱ启动子和终止子序列构建的载体。所用的启动子多数集中在人的巨细胞病毒 (humaneytomegalovirus，hCMV)、猿病毒40(simianvirus40，Sv40)等启动子。

优点：除了负链病毒拯救负责合成病毒蛋白外，在正链病毒也有利用。

在病毒基因组cDNA的5’和3’同时引进HDV核酶，这样产生5’不加帽，3’不含有冗余序列的病毒RNA，并在实验中取得不错的效果。

通过转染重组DNA质粒，直接使用真核生物RNAPolⅡ启动子去驱动病毒cDNA转录。

缺点：CMV的转录本5’有帽子结构，影响了病毒RNA的感染性。

利用PolⅡ系统可能带来一级转录本被剪辑的风险，这也可能阻止这个拯救系统对特异的病毒的成功应用。

在病毒基因组cDNA的5’和3’同时引进HDV核酶的切割效率是有限的，它要求在转录本的3’端要有必要的修饰，切割效率低，还有许多病毒基因组两端含有冗余序列也可能是导致该系统拯救效率低的原因。

4）polⅠ-polⅡ双启动子拯救系统

在pol I启动子与终止子间插入polⅡ启动子和多聚腺苷酸，再将病毒基因插入该系统，利用细胞酶系统

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拯救出病毒；

优点：可以在拯救株上引入多个变异位点，减弱毒株活性，研制出安生性更好的弱毒疫苗。拯救效率相对较高。

缺点：拯救的病毒变异可能性大。

16．反向遗传系统在生物医学研究中的应用有哪些？请举例说明。 答：

1) 病毒基因功能方面：RNA病毒感染性克隆的构建，突破了对单一基因研究的局限，从病毒整体与分子之间、病毒与宿主关系方面研究病毒的毒力和致病性。可以采取基因敲除、插入、置换或构建嵌和病毒等方法对病毒基因功能进行研究。如Nishigahara将G蛋白基因替换事先构建的弱毒株RC-HL反向遗传学系统中相应基因，制备出嵌合病毒。将该嵌合病毒脑内接种小鼠后，与Nishigahara株一样可以引起小鼠死亡。证明G基因是RV毒力决定基因，也表明G蛋白在病毒吸附过程中具有重要作用。比较RC-HL株和Nishigahara株的G蛋白基因后发现242、255、268位的氨基酸发生了变异。在构建的弱毒株RC-HL反向遗传系统中逐步把242、255、268位的氨基酸替换为Nishigahara株的G蛋白基因，发现任何一个氨基酸被替换后致病性都会增加。将弱毒rHEP株G基因333位氨基酸替换为精氨酸后致病性大大增加。进一步证实G 蛋白333位氨基酸是毒力决定位点。

2) 阐明病毒的起源和致病机制方面：这方面禽流感病毒H5N1株和1918西班牙流感人类及动物RNA病毒株的例子可供借鉴。目前SARS病毒的家猫、雪貂动物模型已经建立，从野生动物上分离到的SARS病毒也测出全序列将来可结合感染性克隆对病毒起源和致病性进行研究。

3) 新型疫苗方面：主要有以下几个方面：(1)寻找出与毒力相关位点，通过对毒力决定性基因的缺失或修饰得到一种无毒或减毒毒株，以此制备新型的减毒活疫苗。如缺失FMDV细胞吸附位点的编码序列或前导蛋白酶的编码序列可得到FMD的减毒毒株，将其作成减毒活疫苗免疫动物可获得较好的免疫效果。

(2)研制嵌合疫苗，开发多价疫苗，例如在DEN4感染性克隆的基础上构建型间嵌合体，表达DEN1、DEN2、DEN3的结构蛋白，以此为基础做成多价疫苗，能为实验动物提供保护作用。(3)新型核酸疫苗即RNA疫苗，RNA疫苗克服了DNA疫苗可能引起细胞转化的潜在危险，也解决了DNA疫苗进入细胞核困难、表达量低下的缺陷。因此RNA疫苗是一类很具希望的新型疫苗。(4)利用感染性克隆作为现有减毒活疫苗的种子批，可以减少生产批次间的差异，保持疫苗的稳定性和安全性。

4) RNA病毒载体方面：RNA病毒载体与传统活病毒载体相比，以RNA病毒作为载体具有如下优点：(1)基因组较小利于操作。(2)多数感染哺乳动物的RNA病毒只在胞浆中增殖和转录基因组，引起特异病毒蛋白的高效表达，并且可防止宿主对外源性RNA 的核剪切造成的损害。 源基因的表达不受宿主的控制，RNA病毒没有DNA相，避免了病毒DNA整合到宿主细胞DNA上。( …… 此处隐藏：2857字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……