2012细胞工程教学提纲及补充思考题 - 图文(7)

? 必须首先解决的重要问题：细胞生长及代谢途径基础研究、反应器结构与工艺优化

? 七、植物细胞两相培养技术

? 两相培养技术——在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培养体系形成上、下两相，细胞在水相中生长，合成的次生代谢产物分泌出来后转移到有机相中的技术。其优点是：不仅减少了产物的反馈抑制作用，提高产物含量，而且通过有机相的回收循环使用实现了连续培养。这种技术最初是应用于蛋白质提取、乙醇发酵及微生物培养上的。 ? 两相培养系统满足条件：

? 1、添加的有机物或多聚化合物对植物细胞无毒，不会影响细胞生长。 ? 2、产物能比较容易被有机物吸附或溶解于有机相中。 ? 3、两相容易分离

? 4、有机物或多聚化合物不能吸收培养基中的有效成分。 ? 八、植物细胞的生物反应器固定化培养

? 细胞固定化——将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制备成的网状支持物中，培养液呈流动状态进行无菌培养的一门技术。 ? 常用的固定化方法：吸附法、包埋法、结合法、交联法等。常采用包埋法，可以采用海藻酸盐、卡拉胶、琼脂、琼脂糖、角叉藻胶、白明胶等作为包埋剂。

? 九、植物细胞培养存在的问题与发展趋势 ? 1、存在问题 ? （1）技术问题

? 生物反应器设计缺陷多 ? 细胞易聚集分层、易变异 ? 放大培养不足 ? （2）经济方面

? 成本高、工业化经济效益低 ? 2、发展趋势

? （1）高效细胞系的筛选

? （2）发展大规模细胞培养所用的培养基，降低成本 ? （3）开发出适合植物细胞大规模培养的生物反应器系统 ? （4）两相培养、固定化培养技术是极具发展前景的技术

? （5）对细胞分化、次生代谢产物和培养条件之间的关系进行基础研

究

第5节 植物原生质体培养 ? 5.1 定义、特点及用途 ? 5.2 原生质体的制备 ? 5.3 原生质体的培养

? 5.4 原生质体的发育和植株再生 ? 一、原生质体 ? 1、定义

? 在植物细胞中除细胞壁以外的成分就称为原生质体，植物原生质体实际上就是除去细胞壁的裸露球形细胞。 ? 2、特点及用途

? 含有核、质、膜及各种细胞器，只是没有细胞壁。方便进行各种遗传操作，并能摄取外源基因、细胞器、染色体、质粒、病毒、细菌等外源物质，是植物细胞工程进行遗传操作、基因转移的良好实验材料。也可以进行细胞生理生化研究，并且原生质体具有细胞全能性，能够再生出细胞壁并生长发育成完整植株，也可研究细胞壁的形成。另外也容易克服不同种细胞间的不亲和障碍，容易实现细胞融合和细胞杂交，培育新品种。 ? 二、原生质体的制备 ? 1、来源

? 植物体的细嫩部分是制备原生质体的理想材料，比如双子叶植物的幼叶、子叶、根、下胚轴的切段、花粉等。叶片由于取材容易而广泛采用，但单子叶植物特别是禾本科植物叶片表面常含有硅质不易被酶液降解，不适宜用来制备原生质体，通常用其组培产生的愈伤组织或悬浮培养的细胞。 ? 2、分离

? （1）机械法（最初方法）

? 先将材料放在高渗蔗糖溶液中使细胞发生质壁分离，最后原生质体收缩成球形完全与细胞壁脱离，此时用剪刀剪碎组织、切破细胞壁，使原生质体释放出来。这种方法操作难度大，产量低，费时费力，且无法从分生组织中分离得到原生质体。 ? （2）酶解法（常用方法）

这是1960年英国诺丁汉大学的科金创立的分离制备大量植物原生质体的方法。利用从漆斑霉提取的纤维素酶粗制剂，从番茄幼苗根尖分离出

大量原生质体。这种方法条件温和、原生质体完整性好、活力高、得率高。制备原生质体常用的酶有：纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、琼脂酶、蜗牛酶等。

? 例：科金分离制备番茄根尖原生质体方法步骤： ? （1）取材消毒：

? 将鲜嫩植物组织水洗后用70%酒精浸泡1min，再用8%次氯酸钠浸泡1min表面消毒，无菌水洗3～4次。 ? （2）酶解制备

? 超净台上25～28℃恒温水浴60～90min。 ? （3）原生质体收集

? 用300～400目不锈钢网过滤酶解材料，弃去残渣，600r/min离心10min，弃上清，沉淀悬浮在0.16mol/LCaCl2·2H2O溶液中，缓缓注入20%蔗糖溶液，同速离心10min，收集两液面间原生质体带备用。 ? 3、纯化

? （1）过滤-离心法

? 40～100μm网筛－低速离心数次 ? （2）漂浮法

? 25%蔗糖溶液中漂浮－吸管 ? （3）沉降法与漂浮法结合

? 低速离心－21%蔗糖悬浮离心－洗涤液离心（2次以上） ? 4、鉴定

? （1）低渗爆破（低渗吸水膨胀）

? 吸水胀破后不成形－真原生质体

? 吸水胀破后保持一定形状－带有部分细胞壁 ? （2）荧光染色（0.05%～0.1%荧光增白剂） ? 发红光－真原生质体 ? 发绿光－细胞壁未分解完全 ? 5、活力测定

? （1）染色法（FDA、酚藏花红、伊文思蓝）

? ①FDA（荧光素双醋酸盐）法：本没有荧光，能透过原生质膜，并在内酯酶作用下水解为不能排出、积累在质膜内的荧光素。 ? 发绿光－活 不发荧光－死

? ②酚藏花红染料法：不着色－活 红色－死 ? ③伊文思蓝染色法：不着色－活 蓝色－死 ? （2）胞质环流法

? （3）渗透压变化：吸水、失水－活，不变－死 ? （4）氧电极法：O2↑↓－活，不变－死 ? 三、原生质体培养 ? （1）液体培养法 ? （2）固体平板法 ? （3）双层培养法

? 四、原生质体的发育和植株再生 ? （1）细胞壁再生 ? （2）细胞分裂

? （3）愈伤组织或胚状体的形成