2012细胞工程教学提纲及补充思考题 - 图文(10)

? ③葡萄糖

? ④激素（胰岛素、生长激素等） ? ⑤金属离子

? ⑥促贴附物质（纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等） ? ⑦生长因子（EGF、FGF、MSA、IGF等） ? ⑧维持细胞生长繁殖及保持生物学性状不明成分

? 血清常用牛血清和马血清（HS,horse serum），牛血清又分为胎牛血清（FBS,fetal bovine serum）和犊牛血清（CS,calf serum）。血清质量好坏是实验成败的关键。

? 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染

? 血清的消毒：过滤除菌

? 优点：营养成分丰富，培养效果好。

? 缺点：来源有限；成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析；易发生支原体污染；影响后期分离、纯化细胞产物；成本高。 ? （2）合成培养基

? 根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的培养基，如MEM、DMEM、DME、M199、F12、RPMI－1640等培养基，需加入5～20%血清，最常用10%小牛血清。

? 优点：成分已知，便于对实验条件控制，能进行标准化生产，成本低。 ? 缺点：不能完全取代天然培养基的成分，需加入血清，具血清的缺陷。 ? （3）无血清培养基

? 一般由基础培养基、生长因子和激素、基质组成，主要以各种激

素、生长因子、维生素、载体蛋白、微量元素、乙醇胺以及贴壁与展开因子取代含血清培养基中的血清部分。常用培养基有DME、F12、RPMI－1640等，其中又以1︰1的DME和F12混合培养基最为常用。专用无血清培养基如SFRE199－1、NCTC135等。常用基质有纤黏素、血清铺展因子、胎球蛋白、胶原等。

? 优点：排除了血清的干扰，保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。 ? 缺点：不同细胞株添加因子不同；处于研究阶段，难以推广。 ? （4）培养必需的溶液 ? ①BSS（Hanks、Earle等）

? ②pH调整液（NaHCO3、HEPES等） ? ③细胞消化液（胰蛋白酶、EDTA等）

? ④抗生素溶液（青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素等） ? ①BSS（Hanks、Earle等）

? 由生理盐水和葡萄糖配成，用于维持细胞的渗透压、维持pH和细胞正常的代谢等。

? 葡萄糖在培养液中的含量一般为1g/L（低糖）或4.5g/L（高糖）。 ? Hanks 平衡盐溶液(HBSS) 和 Earle平衡盐溶液(EBSS)的主要差别在于碳酸氢钠的水平，在Earle(2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。 Hanks 液缓冲能力较弱，Earle液缓冲能力较强。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的pH值。Earle液在空气水平的CO2 中会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。Hanks 液要在空气中使用，不需要CO2培养箱。如果希望在CO2培养箱中保存

组织，需要用Earle液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。 ? ②pH调整液（NaHCO3、HEPES等）

? 常用的有3.7%、5.6%、7.4%NaHCO3、HEPES液（二羟乙基哌嗪乙烷磺酸）等。

? 培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为3.7 g/L 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为1.5 g/L 时， 则应使用5%CO2 培养细胞。

? ③细胞消化液（胰蛋白酶、EDTA等）

? 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。适用于消化细胞间质比较少的软组织，如胚胎、羊膜、上皮、肝、肾以及传代等。 ? 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。

? 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca 2+、Mg2+的PBS缓冲液配制。常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％ 。用滤器过滤除菌。 ? 胰蛋白酶液消化时间：2～10分钟。 ? ③细胞消化液（胰蛋白酶、EDTA等）

? EDTA（乙二胺四乙酸二钠）是一种化学螯合剂，对细胞具有一定的非酶性解离作用。常用浓度是0.02％ 。

? 也可以将两种消化液以1︰1或1︰2的比例混合使用，用于消化组织、传代细胞等。因二价离子会抑制胰蛋白酶活性，EDTA可以螯

合游离的Mg2+和Ca 2+，以便保持胰蛋白酶的活性。做法可以是：用胰蛋白酶处理细胞前，先用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中的二价离子。

? ④抗生素溶液（青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素等） ? 严格来说，动物细胞应培养在不含抗生素的培养基中，因为抗生素对某些细胞有毒，而且有时会产生假性数据。在一般正常培养状态下，除特殊筛选系统外，培养基中不应添加任何抗生素。

? 通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为100单位/mL。

? 庆大霉素：100单位/mL——方便、广谱、稳定

? 当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。因为血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到毒性水平。 完全培养基的组成

? 基础培养基 80％～95％ ? 血清 5％～20％ ? 碳酸氢钠 2.0 g/L ? 青霉素、链霉素 各100单位／mL 一般培养基的配制

RPMI-1640培养粉 1袋

碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位／mL 加三蒸水 至 1000mL，过滤除菌。

调节pH值至7.2 加血清（终浓度 10％）

一般培养液都含酚红作为pH指示剂，中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色，是细胞培养液状态的一个很好的标志。过长时间的培养或者微生物的污染都会使培养液的pH发生改变。需要注意的是，研究表明，酚红可以模拟类固醇激素（尤其是雌性激素）的作用，所以如果培养的细胞对雌性激素敏感（比如实验本身就是研究雌性激素对细胞的作用），为避免固醇类反应，就应当使用没有酚红的培养液。另外由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，使用不加有酚红的培养液。

? CO2培养箱设定的条件为37 ℃，5％CO2 。 ? 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：

? ①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。 ? ②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90 ℃ ，14 h)。 ? ③箱内将无菌蒸馏水3000mL置蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发（至少每两周一次）。 清洁液的配制