2012细胞工程教学提纲及补充思考题 - 图文(11)

培养用品清洗和消毒程序

白箭头：玻璃制品 黑箭头：橡胶制品

? 动物细胞、组织培养体系：

? 动物细胞可以利用整体生物（如鸡胚），或离体器官（如鼠肝）或血液（如淋巴细胞），特别是在必要时使用温和酶解技术建立动物细胞培养体系。在理论上可以利用任何来源的有活力的具核细胞进行培养。但实践中，使用幼嫩的、生长活跃的组织实验的成功率最大。 ? 动物细胞培养的原则： ? （1）安全性

? 了解细胞培养传染的潜在危险性是十分重要的。尽管与人类细胞相比，禽类与啮齿类动物传播疾病的几率较小，但所有细胞培养都必须看作是致病微生物的潜在来源，任何时候都要采用无菌技术，需要

遵循安全规则。 ? 动物细胞培养的原则： ? （2）连续培养细胞系

? 刚分离的新鲜细胞能反映活体细胞的生化活性，但其培养寿命有限，长期研究需反复分离。连续细胞系相对容易培养，其培养时的生长需求已经研究清楚，特别是对已广泛应用的细胞系(如BHK、HeLa)的了解更清楚。因为连续细胞系是无性系，其反应更容易重复，结果比原代培养物较少变化。 ? （3）对固体基质的要求

? 有些细胞附着在固体表面才能生长，贴壁依赖是原代培养有限细胞系的典型特征。这些细胞一旦在附着表面形成连续的单层，则表现出依赖密度的生长抑制现象。使用―微珠载体‖作为特定的支持物可以培养这些细胞。相比之下，许多连续细胞系可以以单个细胞或细胞团的形式维持在悬浮培养基中。

体外培养的细胞大多具有生长接触抑制的特性，也就是说当一个细胞被其他细胞包围的时候，它就会停止生长。当细胞铺满培养器皿的表面时，正常的细胞停止生长，但是转化（即发生遗传物质突变）的对接触抑制不敏感的细胞会继续生长。如果不及时传代，这些转化的细胞就会逐步取代正常的细胞。 ? （4）理化条件

? 包括pH（一般为7.2～7.5）、缓冲能力、渗透压和温度(如哺乳动物细胞为35～37℃) ? （5）对培养基的要求

? 包括无机离子、碳源、其他有机养料、抗生素等。常在培养基中加入血清或含有蛋白质、多肽、激素、脂类和微量元素的类血清附加物。考虑体外CO2和O2的水平：许多细胞培养使用碳酸氢盐做缓冲液，这样维持空气中高含量的CO2。用pH调整液维持pH平衡。有时可在培养基中加入pH敏感的染料（如酚红），在动物细胞生长过程中直接检测pH状态。 ? （6）对设备的要求

? 使用超净工作台或安全操作间，为了减少微生物污染，需使用合适的培养容器（如灭过菌的一次性聚苯乙烯培养板、瓶和培养皿），经处理，这些容器表面带负电荷，亲水性好。在细胞生长过程中高质量纯水（蒸馏、去离子和碳过滤的水）、温度变化±0.5℃的培养箱，通常还具备CO2控制器和机械搅拌器，还有倒置相差显微镜用来测定生长的单层黏附细胞。 ? 三、动物细胞培养的传统方法 ? 1、悬滴法 ? 2、旋转管法 ? 3、灌注小室法 ? 4、培养瓶法 ? 5、培养板法 ? 1、悬滴法

? （1）在盖玻片上滴加胚胎提取液、血浆、植块，混匀、包埋； ? （2）在凹形载玻片周围涂凡士林，凹载片向下压向盖玻片； ? （3）反转凹载片，盖玻片周围涂熔蜡密封，培养箱培养。

? 2、旋转管法

? 为克服静止培养的不足而建立的培养方法。即将培养物在一管状培养器皿上利用旋转装置进行旋转培养的方法，使培养物可以交替接触培养液和气体环境。 ? 3、灌注小室法

? 将细胞接种于一个由上下两个盖玻片与一个金属圈密封围成的小室内，侧面有培养液流入和流出的开口，保持在一定条件下培养的方法。

? 这种方法培养液可以循环供应，由此减少细胞受代谢产物积累的影响。 ? 4、培养瓶法

? 将培养物接种于培养瓶放于培养箱培养的方法，也可以将培养物接种于盖玻片上再放入培养瓶里培养。 ? 5、培养板法（微量培养法）

? 是现代动物细胞体外培养技术最常用的一种方法，具体方法是将培养细胞接种在6孔、24孔或96孔培养板的孔内，在CO2培养箱里进行培养。

? 四、原代培养与传代培养技术 ? 1、组织块培养

? 是细胞培养技术最简单最常用的方法。 ? 原代培养过程：

? 取下组织→除杂、剪碎→ BSS液冲洗、离心取材→剪成细块→BSS液冲洗、自然沉降→留少许洗液→移入培养瓶中→吸尽洗液、加入少

量培养液薄层培养→培养24h左右补充培养液培养→细胞贴壁生长 ? 2、组织消化培养 …… 此处隐藏：108字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……