微生物初级考试细菌部分(4)

芽胞杆菌和炭疽芽胞杆菌等)的鉴别。

五、肠毒素试验(食品)

(一)酶联免疫吸附试验（ELISA）检测LT（双抗体夹心法测抗体）和ST（抗原竞争性测定抗原）

1、产毒培养： 将试验菌株和阳性及阴性对照菌株分别接种于0.6ml CAYE 培养基内．37℃振荡培养过夜。

加入20 000u／m1的多粘菌素B 0.05ml，于37℃1小时，离心4000转／分15分钟，分离上清液，加入0.1％硫柳汞0.05ml，于4℃保存待用。

2、LT检测方法(双抗体夹心法)： ①包被：先在产肠毒素大肠埃希菌LT（(双抗体夹心法)和ST（抗原竞争）酶标诊断试剂盒中取出包被用LT抗体管，加入包被液0.5ml，混匀后全部吸出于3.6ml包被液中混匀，以每孔100ul量加入到40孔聚苯乙烯硬反应板中，第一孔留空作对照，

于4℃冰箱湿盒中过夜。②洗板：将板中溶液甩去，用洗涤液I洗3次，甩尽液体，翻转反应板，在吸水纸上拍打，去尽孔中残留液体。

③封闭：每孔加100ul封闭液，于37℃水浴中1小时。④洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。⑤加样本：每孔分别加各种试验菌株产毒培养液100ul，37℃水浴中1小时。⑥洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。⑦加酶标抗体：先在酶标LT（双抗体夹心法）抗体管中加0.5ml稀释液，混匀后全部吸出于3.6ml稀释液中混匀，每孔加100ul，37℃水浴中1小时。⑧洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。

⑨酶底物反应：每孔(包括第1孔)各加基质液100 ul，室温下避光作用5～10分钟，加入终止液50 ul。

⑩结果判定：以酶标仪在波长492nm下测定吸光度OD值，

待测标本OD值大于阴性对照3倍以上为阳性，目测颜色为桔黄色或明显高于阴性对照为阳性。

3、ST检测方法(抗原竞争性) ①包被：先在包被用ST（抗原竞争性）抗原管中加0.5mL包被液，混匀后全部吸出，于1.6ml包被液中混匀，

以每孔50uL加入于40孔聚苯乙烯软反应板中。加液后轻轻敲板，使液体布满孔底。第l孔留空作对照，置4℃冰箱湿盒中过夜。

②洗板：用洗涤液I洗3次，操作同上。③封闭：每孔加100uL封闭液，37℃水浴1小时。④洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。

⑤加样本及ST(抗原竞争性)单克隆抗体：每孔分别加各试验菌株产毒培养液50uL稀释的ST单克隆抗体50uL(先在ST单克隆抗体管中

加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出，于1.6ml稀释液中混匀备用)，37℃水浴l小时。⑥洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。

⑦加酶标记兔抗鼠Ig复合物：先在酶标记兔抗鼠Ig复合物管中加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于3.6ml稀释液中混匀，

每孔加100uL，37℃水浴中l小时。⑧洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。⑨酶底物反应：每孔(包括第1孔)各加基质液100uL， 室温下避光5～10分钟，再加入终止液50uL。

⑩结果判定：以酶标仪在波长492nm下测定吸光度(OD)值：

(二)双向琼脂扩散试验检测LT（双抗体夹心法测抗体）：

将被检菌株按5点环形接种于Elek培养基上。以同样操作，共做2份，于36℃培养48小时。

在每株菌的菌苔上放多粘菌素B纸片，于36℃经5～6小时，使肠毒素渗入琼脂中。在5点环形菌苔各5mm处的中央，挖1个直径4mm的圆孔，并用l滴琼脂垫底。在平板的中央孔内滴加LT（双抗体夹心法测抗体）抗毒素30uL，用已知产LT和不产毒菌株作对照，于36℃经15～20小时观察结果。在菌斑和抗毒素孔之间出现白色沉淀带者为阳性，无沉淀带者为阴性。 (三)乳鼠灌胃试验检测SI'（(抗原竞争性)

将被检菌株接种于Honda产毒肉汤内，于36℃培养24小时，以3000转／分离心30分钟，

取上清液经薄膜滤器过滤，加热60℃30分钟，每lml滤液内加入2％伊文思蓝溶液乱0.02ml。

将此滤液用塑料小管注入l～4日龄的乳鼠胃内0.11ml，同时接种3～4只，禁食3～4小时后用三氯甲烷麻醉，

取出全部肠管，称量肠管(包括积液)重量及剩余体重。肠管重量与剩余体重之比大于0.09为阳性，0.07～0.09为可疑。

六、结果报告

综合上述牛化试验、血清学试验、肠毒素试验作出报告。

八、其 他 属（肠道菌疾病检验—肠道属） (一)克雷伯菌属（肠道菌疾病检验—肠道属）

克雷伯菌属细菌一般不致病，当机体免疫力低下时，能引起多种感染。 对人类关系密切的有①肺炎克氏菌和②臭鼻克氏菌和③鼻硬结克氏菌。 肺炎克氏菌是形态较短粗的革兰阴性杆菌，常见端端排列，无鞭毛，多数有菌毛，有较厚的荚膜。营养要求不高，在普通培养基上生长的菌落大，呈粘液状，相互融合，以接种环挑之易拉成丝。

肺炎克氏菌是除大肠杆菌外的最重要条件致病菌，已成为医源性感染的重要细菌。

存在于人类肠道、呼吸道及水和谷物中，当机体免疫力降低或应用免疫抑制剂，也可因长期大量使用抗生素导致菌群失调而引起感染。常见有支气管炎、肺炎、泌尿道和创伤感染，有时导致严重的败血症、脑膜炎、腹膜炎等。

(二)变形杆菌属（肠道菌疾病检验—肠道属）

变形杆菌属中与医学关系密切的包括①普通变形杆菌和②奇异变形杆菌，为多形性的革兰阴性杆菌，可为球形或丝状，无荚膜，幼龄培养物中有周身鞭毛，运动活泼。有菌毛，可粘附至植物和真菌细胞表面，但不与动物组织细胞或红细胞表面吸附。

需氧或兼性厌氧。

营养要求不高。在固体培养基上常呈扩散生长，形成以菌接种部位为中心的厚薄交替、同心圆形的层层波状菌苔，称为迁徙xi(迁移的意思)生长现象。在血琼脂平板上有溶血现象。能迅速分解尿素，是本属的一个重要特征。个别菌株发酵乳糖。变形杆菌根据菌种抗原分群，再以鞭毛抗原分型，现至少分为100多个血清型。X19、X2、和XK菌株含有特殊菌体O抗原，可与某些立克次体的部分抗原发生交叉反应，

故可替代立克次体作为抗原与患者血清进行凝集反应，此称为外斐试验，以辅助诊断斑疹伤寒、恙虫病等立克次体病。

变形杆菌属在自然界分布广泛，人和动物肠道也经常存在。对人类一般不致病，在特定条件下可单独或与其他细菌混合感染。

变形杆菌是尿道感染最常见菌之一，其尿素酶可分解尿素产氨，使尿液pH增高，碱性环境有利于变形杆菌的生长。肾结石和膀胱结石的形成与变形杆菌属可能也有关，因该菌属可使尿碱化促进磷酸铵镁结石的形成。

变形杆菌还能引起皮肤、耳、乳突小房、眼等局部感染，以及腹膜炎、败血症等，有的菌株可引起食物中毒。

(三)肠杆菌属（肠道菌疾病检验—肠道属）

为革兰阴性的杆菌或球杆菌，具周鞭毛，能运动，有些菌株有荚膜，无芽胞。兼性厌氧，无特殊营养要求，最适生长温度为30℃。

在营养培养基中均匀浑浊，有菌膜。对大多数对糖类产酸产气，但44.5℃只产酸不产气，

IMViC(吲哚形成、甲基红反应、VP反应和枸橼酸盐利用试验) 反应大多为+ + - -。是肠杆菌科中最常见的环境菌群，但不是肠道的常居菌群。在水和日常食品中比埃希菌属更常见，常自尿道感染和败血症时分离出，为机会病原菌（肠杆菌）。（肠杆菌比大肠埃希菌感染更常见） (四)沙雷菌属（肠道菌疾病检验—肠道属）

与医学有关的是①粘质沙雷菌和②液化沙雷菌，革兰阴性菌，具周鞭毛、能运动，一般无荚膜，不产芽胞。

兼性厌氧，营养要求不高，菌落不透明，常呈白色、粉红色或红色。液体培养物形成菌膜。触酶强阳性，氧化酶阴性，发酵葡萄糖产气或不产气，VP阳性，DNA