抗菌肽CecropinD在毕赤酵母中的表达_纯化及活性鉴定

毕赤酵母文献

中国生物制品学杂志2008年3月第21卷第3期 ChinJBiologicalsMarch2008,Vol.21 No.3

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中国图书分类号 R392.11 Q786 文献标识码 A 文章编号 1004 5503(2008)03 0185 05

基础研究

抗菌肽CecropinD在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定

尹娜 李鸿钧 彭梅 谢天宏 张光明 施锐 孙茂盛

摘要 目的 在毕赤酵母GS115中表达抗菌肽CecropinD,并检测其抗菌活性。方法 根据毕赤酵母密码子的偏爱性,人工合成6条寡聚核苷酸片段,经磷酸化、退火、连接并克隆入酵母表达载体pPIC9K。重组表达质粒pPIC9K D转化至毕赤酵母菌GS115,经G418筛选,阳性高拷贝克隆用0 5%的甲醇诱导表达,表达产物经CM Sepharose层析柱纯化,Tricine SDS PAGE分析,琼脂糖扩散法和比浊法测定其抗菌活性。结果 经Tricine SDS PAGE检测,在相对分子质量3900左右处可见目的蛋白表达条带,纯化后的目的蛋白纯度达90%以上,获得的抗菌肽CecropinD对一些革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抑菌活性。结论 抗菌肽CecropinD成功地在毕赤酵母中分泌表达,为以后深入研究抗菌肽奠定了基础。

关键词 抗菌肽;CecropinD;毕赤酵母;分泌表达;抗菌活性

ExpressionofAntibacterialPeptideCecropinDinPichiapastorisandPurification

andActivityofExpressedProduct

YINNa,LIHong jun,PENGMei,etal(InstiuteofMedicalBiology,PekingUnionMedicalCollege,ChineseAcademyofMedicalSciences,Kunming650118,China)

Abstract Objective ToexpressantibacterialpeptidececropinDinPichiapastorisanddeterminetheactivityofexpressedproduct.Methods SixoligonucleotidefragmentsweresynthesizedaccordingtothecodonbiasofPichiapastoris,thenphosphorylated,annealed,linkedandclonedtoexpressionvectorpPIC9K.TheconstructedrecombinantplasmidpPIC9K DwastransformedtoPichiapastorisGS115,andposi tivecloneswerescreenedwithG418forexpressionunderinductionof0.5%methanol.TheexpressedproductwaspurifiedbyCMSepharosechromatography,idntifiedbyTricine SDS PAGE,anddeterminedforantibacterialactivitybyagarosediffusiontestandturbidimetry.ResultsCecropinDwitharelativemolecularmassofabout3900wasexpressedandreachedapurityofmorethan90%afterpurification.ItshowedantibacterialactivitytobothGram positiveandnegativebacteria.Conclusion CecropinDwassuccessfullyexpressedinPichiapastoris,whichlaidafoundationoffurtherstudyonantibacterialpeptide.

Keywords Antibacterialpeptide;CecropinD;Pichiapastoris;Secretoryexpression;Antibacterialactivity

1975年瑞典科学家Boman等人从惜古比天蚕蛹中诱导分离得到一种抗菌肽,并将其命名为Ce cropin。这种多肽可以在细菌细胞质膜上穿孔,形成离子孔道,造成细菌细胞膜结构破坏,引起胞内水溶性物质大量渗出,最终导致细菌死亡[1]。抗菌肽具有广谱的抗菌活性[2],而且不易诱导抗药菌株的产生,有希望成为新一代抗菌剂[3]。

抗菌肽在生物体内含量低,相对分子质量小,提取与纯化困难,而化学合成成本较高。因此,目前国内外大多采用基因工程的方法大量制备抗菌肽。抗菌肽能够直接杀伤原核细菌,不宜在原核宿主菌中直接表达,只能采用融合表达[4]或在酵母中分泌表达。本研究采用人工合成抗菌肽CecropinD基因,

基金项目:云南省自然科学基金资助项目(No:2004C0029Q).作者单位:中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所

分子生物室(昆明650118).

,mail:com

在毕赤酵母中进行分泌表达,并通过琼脂糖扩散法

和比浊法测定其抗菌活性。1 材料与方法1 1 质粒及菌株

表达质粒pPIC9K和毕赤酵母GS115购自Invit rogen公司;大肠杆菌DH5 和BL21由本实验室保存;金黄色葡萄球菌由云南大学微生物实验室惠赠;大肠杆菌标准株、乙型溶血链球菌、大肠杆菌C3000和耐药性菌株ESD由昆明医学院第一附属医院检验室惠赠。1 2 试剂

限制性内切酶Xho!、BamH!、EcoR!、T4DNALigase和T4多聚核苷酸激酶等购自TaKaRa公司;Aerylamide、Bisaerylamide和Pfu等购自上海生工生物工程有限公司;小相对分子质量marker为Bio Rad

毕赤酵母文献

中国生物制品学杂志2008年3月第21卷第3期 ChinJBiologicalsMarch2008,Vo1.21 186

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和G418为Ameresco产品;引物由TaKaRa公司合成;其余常用试剂为国产或进口分析纯。

1 3 CecropinD基因引物合成

根据毕赤酵母密码子的偏爱性[5],人工合成6条寡聚核苷酸片段:Oligo1~Oligo6,其覆盖整个Ce cropinD基因片段;同时还合成了两对引物:D5、D3及 5、 3,见表1。

表1 引物/寡聚核苷酸序列

Tab1 Sequencesofprimersandoligonucletide

OligoPrimer

Sequence

Oligo15#AAAAGATGGAACCCATTCAAGGAGTTGGAGAAGGTTGG3#Oligo25#TCAAAGAGTTAGAGACGCTGTTATTTCCGCTGGTCCAG3#Oligo35#CTGTTGCTACCGTCGCTCAAGCTACTGGTTTGGCTAAG3#Oligo45#CAGCGTCTCTAACTCTTTGACCAACCTTCTCCAACTCCT3#Oligo55#GAGCGACGGTAGCAACAGCTGGACCAGCGGAAATAA3#Oligo65#TTACTTAGCCAAACCAGTAGCTT3#D5D3 5 3

5#ATTCTCGAGAAAAGATGGAACCCATTCAAGGAG3#5#TACTTAGCCAAACCAGTAGCTTG3#5#ATTCGAAGGATCCAAACGATG3#5#CTCTCTTTTCTCGAGAGATAC3#

图1 重组质粒pPIC9K D的构建示意图

Fig1 ConstructionofrecombinantplasmidpPIC9K D

1 6 pPIC9K D的转化及筛选

取Sal!线性化的pPIC9K D10 l,与80 l感受态酵母菌GS115混匀,转移至冰冻的0 2cm电转杯

中,冰上放置5min;1 5kv,25 F,200 ,电击5ms;立即加入1ml冰冻的1mol/L山梨醇,取200 l混合物,涂布于MD板,30 培养,挑取MD板上生长的单菌落200个,接种至含G418(0 5mg/ml)的YPD平板,30 培养48~72h,再将生长的菌落依次接种至G418浓度为1 0、2 0、3 0和4 0mg/ml的YPD平板。采用PCR方法分析转化子,用煮&冻&煮法制备PCR模板[6],以 5和D3为引物,反应体系及反应条件均同上。

1 7 CecropinD的诱导表达及纯化

取筛选出的高拷贝阳性克隆,接种于YTG培养基中,350r/min,30 培养至A600=12,收集菌体,将菌体悬浮于YT培养基中,250r/min,30 培养,每隔24h加0 5%甲醇诱导。72h后离心收集上清。用A液(20mmol/L柠檬酸三钠,pH3 0)平衡CM sepharose层析柱,将收集的上清直接上柱,B液(A液+0~1mol/LNaCl)线性梯度洗脱,流速1 0ml/min,时间200min。收集洗脱峰,进行Tricine SDS PAGE1 8 CecropinD抗菌活性的测定

参照文献[8]方法。

1 8 1 琼脂糖扩散法:将处于对数生长期的菌体)[7]

1 4 CecropinD基因片段的合成

取上述6条寡聚核苷酸片段(Oligo1~Oligo6)各2 l,加入1%ATP8 l,T4多聚核苷酸激酶1 l,补水至50 l,37 反应2h。将上述反应物降落式退火(95 3min,56 3min,40 3min),再将退火产物经过酚/氯仿抽提,溶于20 lTE中,取8 l连接过夜。以连接产物为模板进行PCR扩增,反应体系为:10%buffer5 l,dNTP1 l,引物D5、D3各1 l,模板1 l,补水至49 l。反应条件:95 变性5min,70 时加入pfu1 l;95 30s,59 3 …… 此处隐藏：9220字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……