胶体金免疫层析法对AFP、CEA和FN的快速检测(3)

上海师范大学硕士学位论文第一章集而发生聚沉，从而使胶体金的颜色由红色变为蓝紫刨２５之７ｌ。少量的高分子物质能促使胶体凝聚，但一定量的高分子物质反而会增加胶体的稳定性。

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图１－１胶粒的双电层结构示意图

Ｆｉｇ．１－１Ｄｏｕｂｌｅ－ｌａｙｅｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｃｏｌｌｏｉｄｇｏｌｄ

金纳米粒子除具有一般纳米粒子的表面效应、量子尺寸效应外，同时还具有良好的生物相容性Ｉ冽。由于生物大分子和功能化的纳米金粒子同处于纳米维度，当在相应的生物体系中加入功能化的纳米金颗粒时，其具有定向吸附效应以及富集效应等。两者通过化学或物理吸附可制得既稳定又具有一定计量关系的生物／纳米复合材料。该复合材料又可以用来构建具有特殊功能的超分子结构体系，此外也可以作为检测探针用于研究复杂的生物化学过程。因此，纳米金粒子在生物医学、分子生物学等生物标记分析领域中具有广泛而重要的应用，同时也是当今各国所关注的研究前沿及重要发展方向。

１．２．３免疫胶体金的制备

从纳米金首次发现到作为免疫标记物而得到大规模研究经历了四百多年。大约在１６００年，中世纪杰出医生Ｐａｒｃｅｌｓｕｓ用一种植物的醇提取物还原氯金酸制备“饮用金”，这就是纳米金。直Ｎ１９７１年，Ｆａｕｌｋ等Ｉ冽将纳米金颗粒与兔抗沙门氏菌血清结合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门氏菌的表面抗原，开创了纳米金标记技术。５

第一章上海师范大学硕士学位论文

胶体金（ｃｏｌｌｏｉｄａｌｇｏｌｄ）也称金溶胶，由金盐被还原成原子金后形成的金颗粒悬液。胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Ａｍ）及包围在外的双离子层构成。紧连

在金核表面的是内层负离子（ＡｕＯｉ），外层离子层Ｈ＋则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶液间的悬液状态。一般认为胶体金粒子表面带有负电荷，这种负电荷粒子之间相互排斥形成稳定悬浮的胶体金溶液。金颗粒表面可以包被一层生物大分子（如蛋白）来稳定和保护这些粒子，以免受外来电解质的影响而相互凝聚在一起【３ｍ３２１。胶体金粒子对蛋白的吸附作用取决于ｐＨ值，这是因为蛋白的净电荷取决于溶液的ｐＨ值，在ｐＨ＝ｐＩ时为中性。由于在中性时蛋白溶解度最小，因此这时它水化程度最小，最容易吸附到疏水的金粒子表面。但在实际的胶体会探针制备中，一般胶体金调整为ｐＨ＝ＰＩ＋０．５，这样蛋白带正电，有利于结合更稳定【３３Ｊ。

胶体金探针所用蛋白必须要经过前处理，其目的在于：

（１）去除高浓度的盐分，高浓度的盐分往往干扰蛋白与胶体金的吸附结合，或导致胶体金粒子的凝聚，往往采用低浓度缓冲液中进行透析的方法去除多余的盐分。

（２）使蛋白分子尽量分散为单体，冻干蛋白或高浓度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚为多聚体大分子，可同时与多个胶体金粒子结合，影响标记的灵敏度和定量分析。

（３）使蛋白具有适当的分子量。蛋白分子量过小（３０ｋＤ），形成的蛋白复合体往往是不稳定，可短时间内失活。而分子量过大时，被认为影响探针的灵敏度，特别是已知蛋白的结构与活性中心的情况下，去除对活性影响的结构部分是提高标记灵敏度，延长探针寿命（防止凝集）的有效办法。把分子量过小的蛋白与其它蛋白（如ＢＳＡ，牛血清蛋白等）结合后，能制备出稳定性更佳的探针。

当蛋白前处理完成后，接着要确定胶体金与蛋白结合的最佳ｐＨ值。对于理化性质不确定的蛋白这一步尤为重要。过量的蛋白与不同ｐＨ值的胶体金结合后，只有某一特定ｐＨ值能够形成结合最稳定的探针，在高浓度电解质（如ＮａＣＩ）作用下不会凝聚。不同蛋白的适宜ｐＨ范围的宽窄大不相同。一般选择最小适宜ｐＨ值为最佳ｐＨ值。在确定最佳ｐＨ值后，最后要确定最小蛋白量，即能够形成稳定探针的蛋白的最小量［３４－３６１。如果在制备探针时加入太多的蛋白，不仅造成浪费，６

上海师范大学硕士学位论文第一章而且更为严重的是容易造成探针凝聚，并严重影响标记活性。因为探针溶液中的游离蛋白容易抢先与被检测物位点结合，起到“封闭”（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ）作用，降低检

测灵敏度。同时不同直径的胶体金与同一蛋白结合时，除了蛋白量完全不同外，往往最佳ｐＨ也有一定变化。因此，在免疫金制备的每一环节都应随时监测。

在制备免疫金时，当ｐＨ接近并略为高于蛋白质等电点的条件下标记是比较合适的，在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。一般标记步骤如下：

ｌ、用０．１ｍｏｌ Ｌ．１ＫＥＣ０３或０．１ｍｏｌ Ｕ１ＨＣｌ调节金溶胶至所需ｐＨ；

２、在一定量的金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液（体积为２＂－－３ｍ１），搅拌２～３分钟；

３、在搅拌下，加入稳定剂如３％ＰＥＧ２００００，使其终浓度为０．０５％，或加入５％ＢＳＡ，使其终浓度为１％；

４、于８０００＂－ｑ５０００ｒ ｍｉｎｄ离，ｔ二，３０分钟（根据粒径大小选择不同离心条件），小心吸去上清液（不能倾倒）；

５、沉淀物用硼酸盐缓冲液（含５％蔗糖，１％ＢＳＡ，０．０２％ＮａＮ３，０．１％Ｔｗｅｅｎ．２０）重悬至原体积的１／５，置４℃保存。

１．２．４免疫胶体金的应用

近年来，生物分析技术与纳米技术的深入结合是国际生物医学分析技术领域的前沿和研究热点。尤其是免疫胶体金在生物分析中的广泛应用取得了突破性的进展，在医学诊断、医药卫生、环境检测等领域极具应用前景，引起了世界各国学者的广泛重视，其主要应用如下：

１、胶体金在电镜水平的应用

１９７１年，Ｆａｕｌｋ和Ｔａｙｌｏｒ提出了金标法，并首先用于免疫电镜【３７１。因为在电镜水平，金颗粒具有很高的电子密度，清晰可辨【３捌。胶体金免疫电镜技术就是利用胶体金带有负电荷的性质，使其与抗体通过静电吸附作用结合在一起，从而将抗体标记【３９１，再利用抗原和抗体的特异性结合，在电镜下检测与抗体结合的电子密度高的胶体金，确定抗原位置【柏ｌ。因此，免疫电镜胶体金标记法近年来被成功地应用于生物学的各个方面，并取得了重大进展，解决了一些过去未能解决的问题。７

第一章上海师范大学硕士学位论文胶体金免疫电镜技术可用来研究细菌、病毒、肿瘤和自身免疫疾病等，如在肿瘤研究中，因为肿瘤组织常用其相对特异性的标志物。如肝癌组织过量表达甲胎蛋白、胰岛素样生长因子Ｉ等，结肠癌异常表达癌胚抗原，神经内分泌肿瘤则异常分泌一些激素女ＩＣｈｒｏｍｏｇｒａｎｉａＡ等，使用免疫电镜技术检测这些抗原的表达，有助于相关肿瘤的分型、诊断和鉴别诊断【４１ｌ。

胶体金在电镜水平的研究早，发展快，应用广泛，其最大优点是可以通过应用不同大小的颗粒或结合酶标进行双重或多重标记。直径为３～１５ｎｍ胶体金均可用作电镜水平的标记物。３＂－－１５ｍ的胶体金多用于单一抗原颗粒的检测，而直径１５ｎｍ多用于检测量较多的感染细胞。实验证明，该法样本用量少、检测速度快、对比明显、操作简单、敏感性和特异性高，既可用于抗原检测，也可用于抗体检测，可同时适用于科研和诊断。

２、胶体金在光镜水平的应用

胶体金作为标记物也可以用于光镜检测，取代传统的荧光素、酶等。胶体金标记技术在光镜上的应用早期，主要应用于光学显微镜下检查细胞表面抗原，但由于其灵敏度低而受到限制。２０世纪８０ …… 此处隐藏：2507字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……