蛋白质磷酸化与信号传导

蛋白质磷酸化与信号传导

蛋白質磷酸化與信號傳導

對所有真核生物而言，蛋白質的磷酸化是細胞內信號傳遞的關鍵步驟，舉凡在細胞代謝、生長、增殖、癌變調控方面，蛋白質的磷酸化都扮演著重要角色。目前在真核細胞內已發現有400多種蛋白激酶和1000多種磷酸蛋白。通過蛋白質磷酸化，機體得以改變細胞內蛋白質活性，或藉以改變酵素活性、或藉以傳遞信號、或調節細胞內各個生理過程。隨著愈來愈多的信號傳導路徑被證實與蛋白質磷酸化相關，此一主題己是當今細胞生物學研究的熱點。

蛋白質的可逆磷酸化

蛋白質的磷酸化和去磷酸化是一個可以相互轉化的過程，分別由機體藉由調控細胞內各類蛋白激酶（protein kinases）和蛋白磷酸酶（phosphatases）的活性來啟動或抑制。通過磷酸化和去磷酸化兩種構象的互變，導致蛋白質活性改變而表達其特殊的生理功能。現已證實，細胞的許多功能蛋白，如激酶、酶蛋白、受體、視蛋白、運輸蛋白、收縮蛋白、調節蛋白、核蛋白、離子通道、離子幫浦等，均能發生蛋白質的磷酸化與去磷酸化。蛋白質磷酸化的方式有兩種：一種是蛋白質自身磷酸化，如胰島素受體、C激酶、G激酶、Ca2+·CaM激酶、EGF受體、PDGF受體、IGF-1受體、FGF受體、CSF-1受體、Na+-K+-ATP酶的α亞基、Ca2+-ATP酶的磷酸化等。另一種是由特殊的蛋白激酶催化的蛋白質磷酸化。蛋白質磷酸化的部位可發生在蛋白質的絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、賴氨酸、組氨酸及天門冬氨酸的殘基上，使磷酸化蛋白質發揮著多種多樣的生物學功能。

蛋白质磷酸化与信号传导

細胞內還存在專一性蛋白磷酸酶。這種酶特異地催化酪氨酸和絲氨酸磷蛋白去磷酸化，通過去磷酸化改變多種功能蛋白（激酶、酶、受體、運輸蛋白、收縮蛋白、離子幫浦、離子通道、視蛋白、調節蛋白、核蛋白等）的活性，從而調節細胞的代謝、生長、分化、增殖及轉化，在細胞內生物資訊的傳遞中起極其重要的作用。

新技術：單一細胞之信號傳導

流式分析的主要特色，在於可以同時分析單一細胞的多種特徵，當同時使用多種分子探針，與表面標記，可同時識別出特定的細胞亞群，如Ｔ淋巴細胞(CD3+)、B淋巴細胞(CD19+)、NK細胞，並告知該群細胞族群的胞漿內磷蛋白，是否因外在淚活而被磷酸化？是否能因加入信號傳遞抑制物而去磷酸化？

傳統方法如西方墨漬法，由於屬於大多數分析(Bulk Assay)，一般都預設群體中大多數細胞的作用趨勢相同，作用強度一致，無法顯示異質化群體間的個別差異，如% Responder，實驗報告也只能顯示整體細胞的中間值，無法提供單一細胞的測量值。

研習會

本研習會以周邊血淋巴細胞的啟動為例，來介紹「蛋白質磷酸化」流式分析方法。淋巴細胞的啟動包括一系列連續發生的事件：識別信號、啟動信號的跨膜傳遞、胞內信號傳遞、DNA結合蛋白的活化和轉位、基因的轉錄啟動、新分子的表達、細胞因子的分泌、進入細胞周期等等。

應用phorbol myristate ester（PMA），或合併應用鈣離子導入劑A23187來刺激淋巴細胞，可直接啟動胞漿中信號傳遞途徑中的重要成份Protein Kinase C（PKC），迅速而有效地激活T細胞。PKC可接著活化 Raf - MEK – ERK 信號途徑（如例圖），提供本示範實驗的陽性對照。

蛋白质磷酸化与信号传导

抗癌藥物開發之應用

不少癌細胞都有表現異常高的蛋白質磷酸化現象，這種變化很可能是引起細胞周期調控失常的主因，特別是在所謂Mitogen Activated Protein Kinase (MAP Kinase)信號途徑發生異常信號傳遞的頻率很高。發生的原因可能因為生長因子受體的變異，或Ras癌基因的活化。

多年來，癌細胞內各類異常活性的蛋白激酶和蛋白磷酸酶，一直是各藥廠研發人員有興趣的分子標靶，希望可以針對這些磷酸化蛋白質來設計出可控制癌細胞生長、分裂的藥物，來阻止癌細胞的增殖。國外藥廠目前運用這類原理的抗癌藥物有Met癌基因、CDK細胞周期激酶、CDC25蛋白磷酸酶等之分子抑制劑，並已有數個先驅藥物正進行腫瘤治療的臨床試驗。

信號傳導抑制藥理學研究

如果知道先驅藥物的分子標靶，是針對某特色的信號傳遞路徑，如UO126抑制MEK活性，BAY37-9751抑制Raf kinase活性，研發人員便可以用流式分析分段進行藥動學研究，在體外用細胞核型來研究劑量與時間之關係圖，或在臨床試驗抽血檢查病人之藥效。

蛋白质磷酸化与信号传导

Introducing BD PhosFlow Reagents

蛋白質磷酸化FCM分析試劑

BD Biosciences Pharmingen 提供最完整的蛋白質磷酸化分析試劑，配合既有的一系列表面ＣＤ標記，BD Transduction LaboratoriesTM 讓研究人員可隨心所欲地設計實驗，來瞭解細胞內複雜交錯的信號傳導途徑。特別介紹BD Transduction LaboratoriesTM 系列產品，多色的直接螢光標記，可搭配進行3-、4-、5-、甚至6色螢光分析。

探索細胞儀的強效分析力

可在單一實驗中，同時觀察不同的磷酸化事件，如Caveolint(pY14), ERK 1/2 (pT202/pY204), P38 MAPK (pT180/pY182), Stat1 (pY701), Stat3 (pY705), Stat5 (pY694), Stat6 (pY641)等。可在異質化細胞該群中，圈選出特定該群來分析其胞漿內磷蛋白之磷酸化程度。

蛋白质磷酸化与信号传导

LABORATORY PROTOCOLS 一、試劑、材料： y y y y y y y y

Ficol-Hypaque or CPT tubes

RPMI 1640 medium containing 10% fetal calf serum （pre-warm to 37℃）

40uM PMA (Sigma #P8139; phorbol myristate acetate 40uM working dilution in ethanol) 10% formaldehyde (Ultrapure EM Grade; Polysciences) （pre-warm to 37℃） FACS staining buffer (1x PBS, 1% FBS, 0.09% NaN3) （pre-warm to room temp） BD PhosFlow Antibodies to ERK1/2（BD Pharmingen cat # 612566） BD Anti-Human CD3 Antibody（BD Pharmingen cat # 556611） Phosphate Buffered Solution（pre-warm to 37℃）

y 100% Methanol（Ice cold）

二、 檢體收集、處理：

Peripheral blood samples using EDTA as the anticoagulant were obtained from normal donors. Mononuclear cell suspensions were obtained by density gradient centrifugation on

Ficol-Hypaque, and the concentration adjusted to 1x106/ml in RPMI 1640 medium containing 10% fetal calf serum.

三、 PMA激活淋巴細胞內ERK及MEK

Resuspend cells at 1x106/ml in tissue culture medium such as RPMI 1640 plus 10% fetal bovine serum (FBS), 37° water bath. Activate for 10 min using 40nM PMA (final concentration). Also prepare non-activated control cells using mock treatment.

四、應用BD PhosFlow 流式分析試劑進行直接螢光染色

1. Collect experimental (activated) and control cells in separate polystyrene tubes, pellet by

centrifugation (250 x g) for 5 minutes, and discard supernatant. Resuspend the pellet with 4ml PBS.

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2. While maintaining sample at 37°, fix by adding 1ml 10% formaldehyde to give a final

concentration of 2% formaldehyde. Incubate cells at …… 此处隐藏：4124字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……