PEI及其共聚物的胶囊化siRNA在肿瘤基因治疗中的研究进展(2)

ｋｕ几乎不表达ｓｉＲＮＡ生物活性。作者

Ｆ２５一ＬＭＷ包裹的ｓｉＲＮＡ可ｈ后，生

作用与细胞表面结合并被细胞吞饮后形成内涵体，缓冲细胞内的低ｐＨ。其中的ＰＥＩ增强了水和质子体渗透性释放内容物释放到胞浆［ｓｌ。在胞浆内环境下，络合物中的核酸又从ＰＥｌ分子中游离出来，这个过程就是所谓的质子海绵假说（ｐｒｏｔｏｎ细胞内并发挥生物功能。

２２．１

９．７）ｎｍ者占８１．１７％、（９９．２±１２．１）ｎｍ者占１８．８３％；２．２

牛血清（ｆｅｔａｌ

进行琼脂糖凝胶电泳和免疫印迹定量定性检测．裸ｓｉＲＮＡ在最短的时间（１５ＲＮａｓｅ完全降解，而ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ在２４０代表ｓｉＲＮＡ分子全长的放射性条带，提示ＰＥＩ能有效保护ｓｉＲＮＡ分子的结构完整性。Ｗｅｒｔｈ等【珥研究ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ）。通过这一过程，核酸从细胞外被递送到

２３２Ｐ末端标记的ｓｉＲＮＡ与ＦＣＳ一起孵育２泳和放射自显影照片显示：裸ｓｉＲＮＡ在１５乎全部降解．代表ｓｉＲＮＡ分子全长的放射性条带不再显示；而Ｂ－ＰＥＩＡＦＭ）能显示裸ｓｉＲＮＡ的双链条状结构，加入ＰＥＩ后双链条状结构消失，形成的络合物ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ呈球形和类球形纳米粒，表面光滑【悖一。Ｂｒｅｕｎｉｇ等Ｉ列用琼脂糖凝胶电泳的方法证实：不同的ＰＥＩ和ｓｉＲＮＡ所形成的ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ在表征上存在差异。在研究了分子量为２５分子量为２．６的直链ＰＥＩ（Ｌ－ＰＥＩ）后发现：Ｂ．ＰＥＩ

ＪｅｔＰＥＩ包裹的ｓｉＲＮＡ中，有７０％ｓｉＲＮＡ都能够显示完整分子的时间长达１２０和Ｂ．ＰＥｌ

分析认为ＰＥＩ的分子量越大，胶囊化程度越充分，当到一定程度时，呈过度胶囊化状态，阻碍了ｓｉＲＮＡ

的释放；而分子量太小。拥有的正电荷数目有限．很

难和带负电荷的核酸相互作用，不足以形成对ｓｉＲＮＡ的有效保护。ＰＥＩ以在一２０℃低温下保存数月而无需特殊的佐剂。复苏后与人卵巢癌细胞ＳＫＯＶ．３共同孵育４８物更均匀，氮磷比值（Ｎ／Ｐ）为１２时，粒子的表面电荷呈阳性。Ｇｒａｙｓｏｎ等［２５１报道了分子量为０．８Ｂ．ＰＥＩ、分子量为２２

物活性几乎保持９０％以上。Ｇｒａｙｓｏｎ等【笛Ｉ报道，不同Ｎ／Ｐ比值、ｓｉＲＮＡ浓度与ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ络合物的稳定性有关，只有Ｎ／Ｐ比值在６。８以上、ｓｉＲＮＡ浓度在

２００

ｎｍｏｌ／Ｉ。时，Ｂ．ＰＥＩ

２５

ｋｕ形成的ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ纳米粒才能够保持稳定。

２．３

ＰＥＩ胶囊化ｓｉＲＮＡ纳米粒的细胞摄取

Ｕｒｂａｎ．Ｋｌｅｉｎ等【１９ｌ将荧光标记的ＪｅｔＰＥＩ包裹原

癌基因ＨＥＲ．２（ｎｅｕ／ｃ．ｅｒｂＢ．２）的ｓｉＲＮＡ，然后和ＳＫＯＶ．３细胞一起孵育。共聚焦激光显微镜方法观

察到，３０ｍｉｎ后整个细胞浆内有许多大的荧光点，持续９０—１２０

ｍｉｎ。２

ｈ后荧光明显减弱。这些荧光点代表ｓｉＲＮＡ／ＰＥｌ的胞饮囊泡。将稳定表达荧光素酶

的ＳＫＯＶ．３细胞与浓度分别为０．１、ｌ、１０ｐｍｏｌ／Ｌ的

ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ一起孵育．结果显示：浓度越高者细胞的荧光素酶表达水平越低，这种剂量依赖性的ｓｉＲＮＭＰＥＩ基因表达下调早在２４ｈ就能观察到，４８ｈ后达到高峰、持续数天。Ｂｒｅｕｎｉｇ等例用Ｂ—ＰＥＩ２５ｋｕ、ｓｓＰＥｌ和Ｌ－ＰＥＩ５ｋｕ３种结构的ＰＥｌ分别包裹针对增强绿色荧光蛋白的ｓｉＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ用绿色转染指

示剂ｓｉＧＬＯ作为荧光标记，ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ与中国仓鼠卵巢细胞哑株ＣＨＯ．Ｋｌ共同孵育５ｈ后，共聚焦激

光显微镜方法观察到：位于胞浆内或内涵体内的、呈斑点状离散分布的ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ荧光．以及位于胞浆内、呈均匀分布的、从ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ中释放出来的、具有生物活性的ｓｉＲＮＡ荧光染色。３种ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ与ＣＨＯ．ＫＩ孵育４ｈ后。流式细胞仪观察到：随着Ｎ，Ｐ比值和聚合物浓度的增加，细胞摄取ｓｉＲＮⅣＰＥＩ增加。Ｎ／Ｐ相同时，３种ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ复合物中，随着ＰＥｌ分支的增加，细胞摄取能力逐渐增加，由高到低依次为Ｂ．ＰＥＩ

２５ｋｕ、ｓｓＰＥＩ、Ｌ－ＰＥＩ５ｋｕ。

２．４

ＰＥＩ胶囊化ｓｉＲＮＡ纳米粒的细胞毒性Ｇｒａｙｓｏｎ等闭研究了Ｂ—ＰＥｌ

０．８ｋｕ、Ｌ－ＰＥＩ２２ｋｕ、

Ｂ．ＰＥＩ２５ｋｕ

３种ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ对人宫颈癌细胞亚株

ＨＲ５一ＣＬＩｌ的毒性，３种ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ的半抑制浓度ＩＣ如分别为５０、３７、１９¨ｇ／ｍＬ，说明Ｂ．ＰＥＩ

２５

ｋｕ的毒

性最大。Ｕｒｂａｎ．Ｋｌｅｉｎ等【１９ｌｉ丘过４８ｈ的细胞增殖实验证明：所用剂量的ＪｅｔＰＥＩ及胶囊化纳米粒对ＳＫＯＶ。３

细胞未产生生长抑制．无毒副作用。Ｂｉｅｂｅｒ等１２７研究

表明：低分子量ＰＥＩ体内外的毒性极低，具有高度的生物相容性和高转染率，是一种有效的载体。Ｍｏｇｈｉｍｉ等例报道．ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ的细胞毒性与ＰＥＩ的结构和分子量有关．分子量越低。细胞毒性越低。

３

ＰＥＩ胶囊化ｓｉＲＮＡ纳米粒的生物学表达Ｕｒｂａｎ．Ｋｌｅｉｎ等１１９１用ＪｅｔＰＥｌ包裹针对ＨＥＲ．２基

万方数据

因的ｓｉＲＮＡ，在血清存在的情况下，与ＳＫＯＶ．３细胞一起孵育。２４ｈ后ＨＥＲ．２的ｍＲＮＡ水平降低５０％。持续超过７２ｈ。Ｂｒｅｕｎｉｇ等１２４研究表明：Ｂ．ＰＥＩ２５ｋｕ、

ｓｓＰＥＩ和Ｌ—ＰＥＩ

５ｋｕ

３种结构的ＰＥｌ分别包裹针对

增强绿色荧光蛋白的ｓｉＲＮＡ，然后和ＣＨＯ．Ｋ１细胞一起孵育，ｓｉＲＮＡ的基因沉默效率分别为２５％、４５％；而Ｌ－ＰＥＩ

５

ｋｕ复合物的基因沉默效果极低。结

果还提示：ＰＥｌ分子中引入的二硫键结构有助于ｓｉＲＮＡ从ＰＥＩ胶囊中释放与生物学表达。裸鼠皮下建立的ＳＫＯＶ．３细胞肿瘤模利实验中发现：３０

ｍｉｎ

后，３２Ｐ标记的ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ在肿瘤组织的信号最强．持续３ｈ以上（凝胶电泳显示）。每４８—７２ｈ经腹腔注射ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ，ｌ周后肿瘤明显缩小，肿瘤内

ＨＥＲ．２的ｍＲＮＡ水平减低５０％以上。Ａｉｇｎｅｄ剪搬道，

ＰＥＩ包裹ＰＴＮ基因的ｓｉＲＮＡ，可明显降低ＦＩＮ表达，减缓人脑星形胶质母细胞瘤Ｕ８７的增殖。经裸鼠皮下或腹腔注射，明显抑制了Ｕ８７生长。

Ｗｅｒｔｈ等１２６Ｉ将稳定表达荧光素酶的ＳＫＯＶ．３细胞与ＰＥＩＦ２５．ＬＭＷ胶囊化的ｓｉＲＮＡ一起孵育４８ｈ，

细胞的荧光素酶表达下降８０％，而对照组则没有改

变。相比之下，Ｌ－ＰＥＩ

２２

ｋｕ胶囊化的ｓｉＲＮＡ效果则

明显依赖于ＦＣＳ浓度：２％ＦＣＳ条件下。细胞的荧光素酶表达下降高达８０％，５％、１０％的ＦＣＳ条件下，荧光素表达下降不明显。裸鼠皮下瘤模型中．经腹腔内给予ＰＥＩＦ２５．ＬＭＷ胶囊化的ｓｉＲＮＡ，肿瘤生长抑制明显。新鲜和冻存复苏的ＰＥＩＦ２５．ＬＭＷ胶囊化包裹针对人血管内皮生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒ

ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ

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