蛋白质含量测定方法

蛋白质论文

第27卷第2期2007年6月明　胶　科　学　与　技　术TheScienceandTechnologyofGelatinVol.27.No.2Jun.2007.

　科普讲座　

蛋白质含量测定方法

杨玉芳

摘要:白质浓度的测定,通过对实验的过程和结果的切相关,分析来总结这几种方法的适用范围及实用性。领域。、紫外吸收法、双缩脲通过分析表明,针对不同的待测样品以及对测法、、酸奶、豆浆进行定结果准确性的要求不同,我们可以采用不同蛋白质含量的测定。依此分析比较各种测定的方法来测定样品中蛋白质的含量。蛋白质的方法,总结出各方法的特点及适用条件。

关键词:定氮法;紫外吸收法;双缩脲法;考马斯亮蓝法;蛋白质;测定

蛋白质含量测定法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一

[1]

1　材料与方法1.1　仪器材料

(1)仪器:凯氏定氮仪、紫外分光光度计、

可见光分光光度计、工作离心机、布氏漏斗、抽滤泵。

(2)试剂及原材料:牛奶、酸奶、豆浆、0.12

LpH=4.7醋酸-醋酸钠缓冲液、乙醇-。目前常用的molΠ

有这几种古老的经典方法,即定氮法、双缩脲乙醚等体积混合液、浓H2SO4、40%氢氧化钠、法(Biuret法)和紫外吸收法。另外,还有一种30%过氧化氢、2%硼酸溶液、0.050molΠL标准硫酸钾-硫酸铜接触剂、混合指示近十年才普遍使用起来的新的测定法,即考马盐酸溶液、斯亮蓝法(Bradford法)

[4]

。其中,Bradford法灵剂、标准蛋白溶液、双缩脲试剂、考马斯亮蓝G

-250试剂。1.2　实验方法

(1)凯氏定氮法测定蛋白质含量

敏度最高,比紫外吸收法灵敏10～20倍,比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复

杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。这后3种方法并

将待测样品与浓硫酸共热,含氮有机物即

不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫因为一种蛋白质溶液用这4种方法测定,有可酸铵。为了加速消化,可以加入CuSO4作催化能得出4种不同的结果。每种测定法都不是剂和加入K2SO4以提高溶液的沸点,而加入完美无缺的,都有其优缺点

[3]

。在选择方法时30%过氧化氢有利于消化溶液的澄清。消化

应考虑:(1)实验对测定所要求的灵敏度和精好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之分确度;(2)蛋白质的性质;(3)溶液中存在的干解放出氨,借蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中,扰物质;(4)测定所要花费的时间。本实验分然后用标准盐酸溶液进行滴定,记录,计算出别用以上4种方法对牛奶、酸奶、豆浆进行蛋样品含氮量。每个样品做三次重复测定,取平

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第27卷第2期杨玉芳:蛋白质含量测定方法

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均值。

(2)紫外吸收法测定蛋白质含量

酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质

蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸正,。收紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光

,,由于蛋白

度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,pH,因此要蛋白质溶液在238nm,测定样品时的pH要与测成正比。利用一定波长下,pH相一致。取待测样品制成蛋白浓度大约在0.1～1.0mgΠmL的蛋白质溶液,用紫外分光光度计

、灵敏、快速,不消耗样进行比色,对照标准曲线得出样品含氮量。每品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如,个样品做3次重复测定,取平均值。生化制备中常用的(NH4)2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定,特别适用于柱层析洗脱液的的变化,而不需知道其绝对值。

(3)双缩脲法测定蛋白质含量

双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成

快速连续检测,因为此时只需测定蛋白质浓度经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的

此法的特点是测定蛋白质含量的准确度紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰较差,干扰物质较多,在用标准曲线法测定蛋胺基或两个直接连接的肽键,或能够以一个中白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差,故反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸关,故可用来测定蛋白质含量

。等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核

　　此法的优点是测定较快速,不同的蛋白质取待测样品制成蛋白浓度大约在1～

产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少;主要10mgΠmL的蛋白质溶液,加双缩脲试剂染色的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需30min,用可见光分光光度计进行比色,对照标要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。准曲线得出样品蛋白质含量。每个样品做3

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100

次重复测定,取平均值。

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测定未知蛋白质的浓度。

取待测样品加入考马斯亮蓝G-250试剂

(4)考马斯亮蓝法测定蛋白质含量

由于双缩脲法(Biuret法)存在明显的缺放置5min后,,对照点和许多限制,因此1976年由Bradford建立的考马斯亮蓝法(Bradford法),这是根据蛋白质3,与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测

定法具有超过其他几种方法的突出优点,正在得到广泛的应用:

a.,比Lowry法约高4

凯氏定氮法紫外吸收法双缩脲法考马斯亮蓝法

表1　样品蛋白质含量的测定结果

牛奶

3.09-3.163.11

酸奶

2.13-2.162.18

豆浆

0.812.880.910.86

倍,其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光

吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大2.2实验结果分析

(1)凯氏定氮法可测出全部3种样品的蛋得多。

b.测定快速、简便,只需加一种试剂。完

白含量,测试结果准确,只是蒸馏与吸收装置

成一个样品的测定,只需要5min左右。由于复杂,不便于操作,实验过程所需时间较长,操染料与蛋白质结合的过程,大约只要2min即作复杂。

(2)紫外吸收法无法测出牛奶、酸奶的蛋可完成,其颜色可以在1h内保持稳定,且在5

～20min之间,颜色的稳定性最好,因而完全白含量,测出的豆浆蛋白含量也与实际值相差不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。较大,不具实际使用价值。此方法实验过程简

c.干扰物质少。如干扰Lowry法的K、单,适用于测试无色样品,对于有色样品需进Na、Mg离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、行预处理,排除颜色干扰后才适用于此方法。

+

2+

+

巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

此法的缺点是:

(3)双缩脲法适用于被测的3种样品,实

验操作简便迅速,但其缺点是灵敏度较低,蛋

a.由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族白质量须在1～20mgΠmL时测定结果较准确。

氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同因此实验前要估测被测样品的蛋白含量,把样蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线品稀释至蛋白浓度为1～20mgΠmL。时通常选用γ-球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。

b.仍有一些物质干扰此法的测定,主要的

(4)考马斯亮蓝染色法可以测出被测的 …… 此处隐藏：3100字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……