蛋白质组学研究相关技术及进展

心理学研究参考文献

LETTERSINBIOTECHNOLOGY

生物技术通讯

Vol．19No．6Nov．,2008

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文章编号：1009－0002(2008)06－0903－04

综述

蛋白质组学研究相关技术及进展

赵海豹，林汝仙，王升启

军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京100850［摘要］

蛋白质组学以蛋白质组为研究对象，应用相关研究技术，从整体水平上来认识蛋白的存在及活动方式。随着人类

基因组计划的完成，蛋白质组学的研究也得到了快速发展，与蛋白质组学研究相关的一些技术也日益得到完善和提高。简要综述了近年来蛋白质组学研究中最为重要的样品制备、蛋白质分离、蛋白质鉴定等技术及研究进展。［关键词］

蛋白质组学；样品制备；蛋白质分离；蛋白质鉴定

［中图分类号］

Q71;Q503［文献标识码］A

TechniquesinProteomicsandTheirAdvancement

ZHAOHai－Bao,LINRu－Xian,WANGSheng－Qi

DepartmentofBiotechnology,BeijingInstituteofRadiationMedicine,Beijing100850,China

［Abstract］

Proteomicsinvolvesusingsometechniquestostudytheentiresetofproteinsinabiologicalsample,toun-

derstandtheseproteinsexistenceandactionmodes．Withthecompletionofhumangenomicplan,proteomicsresearchhaddevelopedveryquickly,thetechniquesrelatedwithproteomicsalsogotimprovementanddevelopment．Wereviewedsomeimportanttechniquesrelatedwithproteomics,suchassamplepreparation,proteinseparation,proteinidentificationetc．andtheiradvancement．

［Keywords］

proteomics;samplepreparation;proteinseparation;proteinidentification

白质组学后续研究的分辨率。

不同来源的样品制备方法可能不同，但一般都遵循以下几个基本的原则：第一，尽可能提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白的损失；第二，减少对蛋白的人为修饰；第三，破坏蛋白与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白处于完全变性状态。

细胞中存在许多低丰度蛋白质，这些蛋白通常具有重要的功能，但很难被检测到。而加大蛋白的上样量时，样品中的高丰度蛋白质点又会把低丰度蛋白质点掩盖掉，所以降低样品的复杂程度是满足蛋白质组分析要求的有效的样品制备方法。

以下为几个常用的制备低复杂度样品的手段。

随着人类基因组计划的完成，蛋白质组学的研究日益受到重视。通过蛋白质组的分析来确定基因产物，是基因注解过程中重要的一步。mRNA表达水平和蛋白质水平之间并不存在一一对应关联，已发现通过剪接变异体和必要的翻译后修饰可能会产生数目远远大于基因数目的蛋白质。蛋白质组学研究可以定量检测蛋白表达水平和蛋白转录后修饰、蛋白亚型，以及蛋白质－蛋白质相互作用[1]，从而为研究细胞如何综合处理各种信息提供了行之有效的方案。蛋白质组学研究技术是推动蛋白组学发展和实际应用的动力。随着蛋白质组学应用的日益推广，其相关技术也得到了快速发展。我们就近年来发展起来的主要蛋白质组学研究相关技术进行简要综述，并对其中一些技术的发展应用做了讨论。

1．1去除高丰度蛋白

去除高丰度蛋白质后可以加大蛋白样品的上样量，使一些

1样品制备技术

样品制备是蛋白质组学研究实验操作中最为关键的一步，

低丰度的蛋白质含量达到检测的灵敏度范围。这种方法在处理血清类样品（含有大量的白蛋白）的实验中较常用到，因为在血清中白蛋白和其他10种高丰度蛋白质的含量占其总蛋白量的

所制备样品质量的好坏将直接影响后续试验结果。蛋白质组学研究最常用的双向凝胶电泳（two－dimensionalgelelectrophore-

90％，像细胞因子一类的低丰度蛋白质含量仅为1～5pg／mL，所

以去除血浆中高丰度蛋白质是研究其中低丰度蛋白质的必要步骤。但这种方法也存在一定的缺点，一些潜在的重要生物标记分子在此过程中可能因为与高丰度蛋白质的非特异性结合或固有结合而丢失[5]。

sis，2－DE），最多只能一次成功分离1500个左右的蛋白质点[2]。

具有极性pH值的蛋白质，特别是碱性非常高的蛋白质质以及分子量特别低或特别高的蛋白，用2－DE技术不能有效区分[3]；很多其他种类的蛋白质，包括低丰度蛋白质和疏水性蛋白质也很少能被检测到，特别是细胞质膜蛋白质，占某些细胞蛋白质组的

15％～30％，在2－DE胶上只能检测到其中的1％或者更少，甚至

检测不到[4]。因此，如何制备高质量的蛋白质样品直接影响到蛋

［收稿日期］2008－01－30

［作者简介］赵海豹（1980－），男，硕士研究生；

林汝仙（1967－），女，副研究员

［通信作者］王升启，（E－mail）sqwang＠nic．bmi．ac．cn

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1．2

从蛋白复合物样品中富集目的蛋白

此法在细胞作图蛋白质组学中经常用到。目前已有许多技术被用于目的蛋白的富集。免疫共沉淀技术是利用亲和标记的重组蛋白和直接抗此标记蛋白表位的抗体来完成的[6]。Verhange等曾用一个C端带FLAG抗原表位标签的编码哺乳动物细胞死亡抑制蛋白IAP同源物MIHA的cDNA载体，瞬时转染293T细胞，鉴定到了与MIHA相互作用的蛋白DIABLO[7]。蛋白亲和层析是把重组蛋白或化学合成的生物活性片段固定到树脂上作为探针，直接从细胞提取物中捕获相互作用的蛋白质[8]。Zhang等用此法鉴定到了SOCS－box相互作用蛋白延伸因子B和C[9]。其缺点是，蛋白质相互作用需要参与的蛋白处于特定的蛋白状态，这些蛋白状态是物理方法不能区分的，所以检测到的相互作用可能包括一些没有任何生物意义的非特异性结合。

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法发现了可能对肝癌早期诊断有价值的自身抗体[15]。

2．2高效液相色谱

高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography，

HPLC）基于样品分子在固定相（柱填料）和流动相（淋洗液）之间

的特殊相互作用而实现样品的分离。无须变性处理样品，可实现上样、收集、在线分析的自动化。常用于相对分子质量小于1×103的蛋白质、膜蛋白及低丰度蛋白质的分离。其相关的改进技术包括双向高效液相色谱（2D－HPLC）、毛细管柱反相高效液相色谱（reversedphase－HPLC，RP－HPLC）等，与2－DE相比具有快速、分辨率高的优点[16]。

2．3毛细管电泳

毛细管电泳（capillaryelectrophoresis，CE）技术是在高电场

强度作用下，对毛细管（内径5～10μm）中的样品按分子质量、电荷、电泳迁移率等差异进行有效分离，包括毛细管区带电泳（CZE，依据不同蛋白质的电荷质量比差异进行分离）、毛细管等电聚焦（CIEF，依据蛋白质等电点不同在毛细管内形成pH梯度实现分离）和筛板－SDS毛细管电泳（依据SDS－蛋白质复合物在网状骨架中迁移速率的不同而实现分离）等技术。其优点是可实现在线自动分析，可用于相对分子质量范围不适于2－DE的样品；其缺点是存在对复杂样品分离不完全的现象[17]。

1．3分离细胞器蛋白

由于整个细胞或组织的蛋白组成极其复杂，分析亚细胞结

构蛋白质组可以降低样品复杂度，并使一些相对低丰度的蛋白质得到富集，而且可以提示亚细胞定位和功能信息，从而发现更多在细胞器间发生转移或差异表达的蛋白质[10－12]。