植物抗病基因工程的基本原理与方法

第六章 植物抗病基因工程的基本 原理与方法植物抗病基因工程是通过分子生物学技术获得对植物病 病毒、细菌、真菌、线虫等病害) 害(病毒、细菌、真菌、线虫等病害)具有一定抗性的转基 因植株。 因植株。

1983年首例转基因烟草问世。 年首例转基因烟草问世。 年首例转基因烟草问世 1994年首批转基因作物如延熟西红柿和抗除草剂棉花等获得批准 年首批转基因作物如延熟西红柿和抗除草剂棉花等获得批准进行商品化生产。目前，国内外已报道的转基因作物有 种 多个品系 多个品系。 进行商品化生产。目前，国内外已报道的转基因作物有1 6种70多个品系。

自1986年3月以后，我国已研究的转基因作物 类，涉及的转基因 月以后， 年 月以后 我国已研究的转基因作物47类103种。正式公布的转基因作物：棉花、大豆、西红柿、青椒和矮牵牛。 种 正式公布的转基因作物：棉花、大豆、西红柿、青椒和矮牵牛。

目前，已经商品化的转基因作物所转入的外源基因主要是抗性基 目前，因，只有少数是改良作物品种性状的。 只有少数是改良作物品种性状的。

1 植物抗病基因工程策略1.1 导入植物抗病相关基因和病原菌致病相关基因 在植物抗性基因的利用方面 根据已有的R基因结构特征 设计新的R基因 基因结构特征， 基因。 ◆ 根据已有的 基因结构特征，设计新的 基因。 ◆ 异源表达 基因。 异源表达R基因 基因。 向同一株植物中导入多个R基因 基因。 ◆ 向同一株植物中导入多个 基因。 在病原菌无毒基因的利用方面 转病原菌无毒基因。 ◇ 转病原菌无毒基因。 将病原菌无毒基因和相应的R基因一起导入植物 基因一起导入植物。 ◇ 将病原菌无毒基因和相应的 基因一起导入植物。 导入与植物抗病信号有关的基因。 ◇ 导入与植物抗病信号有关的基因。

1.2 导入植物防卫基因◆ Broglie(1991),et al. 在克隆菜豆几丁质基因的基础上将 CH5B基因修饰改造，通过 质粒转化烟草，获得几丁质酶 基因修饰改造， 质粒转化烟草， 基因修饰改造 通过Ti质粒转化烟草 高效表达的转基因植株，具有协同拮抗枯萎病菌的效果。 高效表达的转基因植株，具有协同拮抗枯萎病菌的效果。 ◆ M.J.Carmona(1993),et al.,将来源于大麦基因组克隆 ， 的硫素基因和来源于小麦cDNA克隆的硫素基因转化到烟草 的硫素基因和来源于小麦 克隆的硫素基因转化到烟草 获得了对P.s.pv.tabaci具有较高抗性的植株。 具有较高抗性的植株。 中，获得了对 具有较高抗性的植株 ◆ 美国孟山都(Monsanto)公司将真菌编码葡萄糖氧化 美国孟山都( ) 酶基因导入马铃薯中，获得了对Ecc引起

的细菌性软腐病具 酶基因导入马铃薯中，获得了对 引起的细菌性软腐病具 有良好抗性的植株。 有良好抗性的植株。

1.3 导入降解病原物致病因子基因◆ H. Anzai(1989),et al.分离到了抗烟毒素(tabtoxin) 分离到了抗烟毒素( 分离到了抗烟毒素 ) 的基因ttr,将基因ttr与 的基因 ，将基因 与CaMV 35S启动子融合成嵌合基 启动子融合成嵌合基 通过农杆菌介导的转化法转入烟草，获得ttr高表达 因，通过农杆菌介导的转化法转入烟草，获得 高表达 量的转基因植株， 量的转基因植株，对烟毒素和病原菌的侵染均表现出良 好的抗性。 好的抗性。 ◆ 菜豆毒素(phaseolotoxin)是一种非寄主专化性毒 菜豆毒素( ) 产菜豆毒素的P.s.pv.phaseolicola菌株通过 菌株通过argK基因 素，产菜豆毒素的 菌株通过 基因 合成一种不被菜豆毒素抑制的OCTaseR酶，从而对该毒 合成一种不被菜豆毒素抑制的 酶 素不敏感。 基因导入烟草和菜豆， 素不敏感。将argK基因导入烟草和菜豆，获得的转基因 基因导入烟草和菜豆 烟草和菜豆对P.s.pv.phaseolicola有较高的抗性。 有较高的抗性。 烟草和菜豆对 有较高的抗性

1.4 导入其它蛋白基因◆ 贾士荣 等(1993)和M.Hassan (1993),et al.向马铃薯 贾士荣,等 和 向马铃薯 导入cecropin基因后提高了马铃薯对青枯病的抗性。 基因后提高了马铃薯对青枯病的抗性。 导入 基因后提高了马铃薯对青枯病的抗性 ◆ J.M.Jaynes(1993),et al.将cecropinB基因导入烟草 将 基因导入烟草 后获得的转基因植株，提高了其对R.solanacearum引起 后获得的转基因植株，提高了其对 引起 病害的抗性。 病害的抗性。 ◆ 黄大年 等(1997)将cecropinB和cecropinD基因导入 黄大年,等 将 和 基因导入 水稻幼胚， 水稻幼胚，获得的转基因水稻植株可明显地提高对水稻 白叶枯病的抗性， 白叶枯病的抗性，同时也获得了高抗水稻条斑病和水稻 白叶枯病的高抗品系。 白叶枯病的高抗品系。

2 植物抗病基因工程的技术环节

◆ 至今已分离的供植物基因工程应用的目的基因有100多个，其中研究得比较多的是抗病毒、 多个，其中研究得比较多的是抗病毒、 基因有 多个 细菌和真菌的基因， 细菌和真菌的基因，能杀死害虫或使害虫拒食的 基因，能抵抗各种除草剂的基因，能抗逆境如干 基因，能抵抗各种除草剂的基因， 高寒、高温盐碱等的基因， 旱、高寒、高温盐碱等的基因，能提高植物体中 蛋白质含量或蛋白质品质的基因等等。 蛋白质含量或蛋白质品质的基因等等。这些基因 中有些是来自植物本身，有些来自微生物， 中有些是来自植物本身，有些来自微生物，还有 少数是人工合成的。 少数是人工合成的

。

2.1 目的基因的分离和鉴定

◆ 对已知序列进行分子克隆

PCR扩增 扩增◆ 从蛋白质到基因序列

构建cDNA文库 文库 构建 构建基因组文库

◆ 与已知基因紧密连锁基因的分离

◆ 根据植株或细胞表型变异进行基因分离转座子导入细胞 野生型 细胞核 DNA

转座子标签法目的形状突变株

图位克隆法构建核DNA文库 文库 构建核

基因挽救技术 基因组相减法 cDNA差式显示 差式显示用转座子序列作 探针进行杂交

构建 核DNA 文库

分析转座子两侧序 列并以此作探针

完整的目的 性状基因 转座子标签法流程图

2.2 表达载体的构建◆ 目的基因分离后，往往需要经过修饰才能应用于 目的基因分离后， 植物基因工程。构建植物表达载体就是在目的基因的5’ 植物基因工程。构建植物表达载体就是在目的基因的 端加上启动子，在基因的3’端加上中止子 端加上中止子， 端加上启动子，在基因的 端加上中止子，以便使外源 基因能在植物中有效地表达，充分发挥其功能。 基因能在植物中有效地表达，充分发挥其功能。 加入启动子区 目前植物基因工程中外源基因常选用的启动子主要 质粒的T-DNA序列上分离的启动 有3类：第一类是从 质粒的 类 第一类是从Ti质粒的 序列上分离的启动 具有真核生物转基因起始所需的TATA盒和 盒和CAT盒； 区。具有真核生物转基因起始所需的 盒和 盒 第二类是CaMV的35S和19S启动子；第三类是从植物 启动子； 第二类是 的 和 启动子 本身分离出来的启动子。 本身分离出来的启动子。

加入转录的加尾序列 真核生物为保证一个结构基因表达完全末端需要有 一个加尾序列。其功能一方面保证转录的终止； 一个加尾序列。其功能一方面保证转录的终止；另一 方面保证形成有活性的mRNA链。植物基因工程中常 方面保证形成有活性的 链 用的加尾序列是AATAAA。 用的加尾序列是 。 插入内含子 内含子是真核生物基因组结构的特点之一。 内含子是真核生物基因组结构的特点之一。在基因 工程中， 工程中，多数不用在目的基因中插入这种片段就能得到 有效的表达，因此，认为它是基因产物功能非必需的。 有效的表达，因此，认为它是基因产物功能非必需的。 但是在实际 …… 此处隐藏：4157字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……