发根农杆菌诱导黄芩毛状根的研究(1)

西北农业学报　2006,15(5):244～247

ActaAgriculturaeBorealioccidentalisSinica

发根农杆菌诱导黄芩毛状根的研究

齐香君,陈秀清3,何恩铭

(陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西咸阳　712081)

3

摘　要:利用发根农杆菌A4,A49615,1.2556诱导中药黄芩外植体,得到黄芩不定根,根据形态和在MS培养基中进行培养证实得到黄芩毛状根,经抗菌素氨苄西林钠500mg/L除菌后,毛状根表现出分枝多,生长快,且能在MS中生长繁殖的特性,为采用生物技术生产黄芩活性成分奠定基础。关键词:黄芩;发根农杆菌;毛状根;诱导

中图分类号:Q949.777.6　　　　文献标识码:A　　　　　2(2Researchariabaicalensisrhizogenes

QIXiang2jun,CHENXiu2qing3andHEEn2ming

(CollegeofLifeScienceandEngineering,ShaanxiUniversityofScienceandTechnology,Xianyang　712081,China)

Abstract:HairyrootswereinducedfromScutellariabaicalensisGeorgibythreekindsofAgrobacteri2

umrhizogenesstrainsA4,A49615and1.2556.Theywererevealedbyappearanceandgrowingonhor2

mone2freemedium.Therearesomesignificantcharacteristicsofhairyrootsaftereliminatingbacteriawithantibiotic,suchasmorebranches,fastgrowthcapacityandgrowthinhormone2freemedia.ItisthebasisforproducingactivecomponentsofScutellariabaicalensisGeorgibybiotechnology.Keywords:ScutellariabaicalensisGeorgi;Agrobacteriumrhizogenes;Hairyroots;Induct

　　黄芩为唇形科(Labiatae)植物黄芩(Scutel2

lariabaicalensisGeorgi)的干燥根,具有多种功效,是常用中药[1]。近年来随着对其活性成分黄芩苷及黄芩素深入研究,发现黄芩苷及黄芩素有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗感染、抗HIV、抗氧化及清除氧自由基以及治疗心血管疾病等作用[2],含有黄芩及其活性成分的药物越来越多,黄芩用量在迅速增加。中药黄芩属于多年生草本植物,生长缓慢,需3～4a种植时间,才能采收,这种情况不仅不能满足市场对黄芩的需求,同时大大限制了黄芩苷的深度开发和利用。发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)在植物遗传改造上有明显地增强次生代谢的作用,通过发根农杆菌感染天然植物,进行遗传转化,建立发根培养系统,培养出的毛状根分枝多、生长快,能在MS上快速生长,可生产原植物中的次生代谢产物,成为

3收稿日期:2006203209　　修回日期:2006203230

植物基因工程和细胞工程相结合的一项新技

术[3]。利用发根农杆菌进行毛状根诱导,然后进行有效成分提取,在别的植物上已有不少报道[3～5]。国外关于黄芩毛状根已有研究报道[6],而国内尚未见有黄芩毛状根诱导的研究,本试验采用发根农杆菌诱导黄芩外植体,成功得到了黄芩毛状根,为解决黄芩资源短缺提供了一个很好的参考方法。

1　材料与方法

1.1　外植体和无菌苗的制备

1.1.1　材料　黄芩种子购自西安万寿路药材市

场,培养基采用含蔗糖30g/L的MS(Murashigeandskoog;1962)培养基,其pH值在灭菌前调至5.8,62苄基嘌呤(62BA)、а2萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)购自中国医药(集团)上海化学试剂公

作者简介:齐香君(1957-),女,河南博爱县人,教授,研究方向:生物制药。E2mail:xiuqingchen@http://www.77cn.com.cn

5期　　　　　　　　　　　　齐香君等:发根农杆菌诱导黄芩毛状根的研究 245

司。1.1.2　方法　方法一:将黄芩种子直接种在土壤中,生长一段时间,取生长的黄芩幼嫩植株,用自来水冲洗干净,75%乙醇浸泡30s,再用0.1%HgCl2溶液表面灭菌5min,无菌水冲洗3～5次,无菌条件下分别切取叶和带节茎段,切成0.5～1cm。

方法二:将黄芩种子按上述方法进行消毒,时间为10min,在MS上长成苗,再切成外植体,接种在MS+1.0mg/mL62BA+0.2mg/mLNAA琼脂培养基上,25℃培养,诱导不定芽分化,腋芽长至3～4cm,将其从茎段上切下,再接种在MS+0.5mg/mLIBA,黄芩无菌苗。1.2　1.2.1　材料A49615,1.2556购于中国普通微生物菌种保藏管理中心,野生型A4由西北大学陕西省生物技术重点实验室贾敬芬教授惠赠,发根农杆菌活化培养基:YEB培养基。1.2.2　方法　将1.2556,A49615的安瓿瓶开封,加入0.5mL的无菌水,使冷冻菌体溶解呈悬浮状,取0.2mL菌体悬浮液,移植于YEB琼脂培养基上,25℃培养,活化2～3次,再挑取单菌落转接到YEB液体培养基中,至摇床上,110r/min,25℃,暗处培养2d,野生型A4,直接转接到YEB液体培养基中,同样进行培养。1.3　毛状根除菌用抗菌素的确定1.3.1　材料　抗生素:氨苄西林钠,哈药集团制药总厂,购自咸阳民生大药房。1.3.2　方法　将氨苄西林钠添加到YEB培养基中(在培养基灭菌后冷却到50℃时加入抗菌素),使之在培养基中的浓度达到500mg/L,将3种发根农杆菌分别涂布到这种培养基上,25℃,暗处培养30h,观察结果。1.4　黄芩毛状根的诱导1.4.1　直接接种法　用无菌的微量进样器吸取活化好的菌液,对黄芩无菌苗的茎部进行注射接种,然后在25℃下暗处培养诱导发根。1.4.2　共培养法　取黄芩无菌苗茎段,转接到MS培养基上,25℃下暗处预培养2d,取出茎段

25℃下暗处培养诱导发根。1.5　黄芩毛状根的鉴别

1.5.1　根据根的形态鉴别　当黄芩毛状根长到2.0cm左右时,将其从外植体上切下,置含抗菌

素氨苄西林钠500mg/L的MS培养基中,每7d

转接1次,连续4次,进行除菌,之后转接到MS上,如有菌重新继续生长,需再转接到含抗菌素氨苄西林钠500mg/L的MS培养基中,直到无菌生长,观察毛状根形态。1.5.2　根据根在MS　MS,25℃下。

　结果与分析

2.1　外植体和无菌苗的制备

黄芩无菌苗可以通过不同的方法获得。常规的方法是将消毒后的种子接在MS培养基中进行无菌苗培养,但是在试验中发现,采用这种传统方法对黄芩无菌苗进行培养时,种子的发芽率低,不易得到大量无菌苗,严重影响了试验后续步骤的进行。在试验中,首先采用通过种植土壤苗的方法来获取无菌苗。如果使用土壤苗进行诱导,虽然生长周期未超过两周的土壤苗容易被发根农杆菌感染,但感染前的消毒操作易引起幼苗的死亡;而两周后的幼苗虽然能够成功完成消毒操作,但此时土壤苗已不易感染转化。通过对多种试验方法进行比较分析,采用对生长两周后的黄芩苗外植体(带节茎段),经过激素诱导产生再生苗,且无杂菌。此时可以随时获取不同生长时期的黄芩外植体,用于毛状根诱导(图1、图2)

。

于无菌培养皿中,划痕,将活化好的菌液倒入培养

皿中,共培养20min,取出用无菌滤纸吸干多余菌液,放回原培养基中暗处培养2d,然后转入含抗菌素氨苄西林钠500mg/L的MS培养基中,

图1　黄芩带节茎段分化

Fig.1　DifferentiationofScutellariabaicalensisGeorgistemswithnode

246 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　15卷

表1　3种发根农杆菌对诱导率的影响

Table1　EffectofthreekindsofAgrobacterium

rhizogenesonhairyrootsinducingrates

发根农杆菌外植体数

感染数诱导率/%

生根情况

Growthof

hairyroots20d后出根,30d明显生

AgrobacteriumNumberofNumberofRateofrhizogenesexplantsinfectioninduction

1.25567068.57

根

A496155036

根细少,菌体

生长旺

10d后出根,生长快,分枝

图2　黄芩无菌苗

Fig.2　SterilizedseedlingofScutellaria

baicalensisG

eorgi

A460610

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