DNA重组1-目的基因的获得

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第四章DNA重组(目的基因的获得)

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限制性核酸内切酶(工具酶已经介绍)

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一、DNA分子片段化天然DNA或化学合成的DNA常需酶切成可连接重组的DNA片段， 天然DNA或化学合成的DNA常需酶切成可连接重组的DNA片段， DNA或化学合成的DNA常需酶切成可连接重组的DNA片段 DNA分子的片段化 常用的切割方法有单酶切 分子的片段化。 单酶切、 即DNA分子的片段化。常用的切割方法有单酶切、双酶 部分酶切等方法 等方法。 切和部分酶切等方法。 1. 2. 3. 单酶切法：用一种限制性内切酶切割DNA样品。 单酶切法：用一种限制性内切酶切割DNA样品。最常 DNA样品 用。 双酶切法：用两种不同的限制酶切割同一种DNA分子。 双酶切法：用两种不同的限制酶切割同一种DNA分子。 DNA分子 部分酶切：指选用的限制性核酸内切酶对其在DNA分 部分酶切：指选用的限制性核酸内切酶对其在DNA分 DNA 子上的全部识别序列进行不完全的切割。 子上的全部识别序列进行不完全的切割。

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DNA分子的限制性图谱 限制酶图谱 map) (restriction map): 描述染色体上限制性 内切酶切割位点之间 距离和顺序的图谱 的图谱。 距离和顺序的图谱。

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特异性DNA片段的PCR DNA片段的PCR扩增 二、 特异性DNA片段的PCR扩增聚合酶链式反应 reaction) (polymerase chain reaction) 即PCR技术，由美国科学家Mullis于1983年 PCR技术 由美国科学家Mullis 1983年 技术， Mullis于 发明，又称基因的体外扩增法 基因的体外扩增法。 发明，又称基因的体外扩增法。 也有人称无细胞分子克隆法。 也有人称无细胞分子克隆法 无细胞分子克隆法。

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PCR技术的用途 PCR技术的用途– 目的基因的扩增与分离； 目的基因的扩增与分离； – 医疗诊断； 医疗诊断； – 基因突变与检测； 基因突变与检测； – 分子进化研究； 分子进化研究； – 环境检测； 环境检测； – 法医鉴定。 法医鉴定。

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(一)、基本原理 )、基本原理变性95 C 95 C90~95℃ ~ ℃ 30’’~1’ ~

70~75℃ ~ ℃ 30’’~2’ ~

延伸 72 C

退火Tm- C Tm-5 C

37~60℃ ~ ℃ 30’’~1’ ~

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动画

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(二)、PCR扩增特异性DNA片段的主要条件 )、PCR扩增特异性DNA片段的主要条件 PCR扩增特异性DNA耐热性DNA DNA聚合酶 1、耐热性DNA聚合酶聚合酶(无校对功能 ①Taq DNA聚合酶 无校对功能 聚合酶 无校对功能) 功能： 功能： 聚合酶活性， 有5’ →3’DNA聚合酶活性， 5’ →3’DNA外切酶活性 聚合酶活性 外切酶活性 无3’→ 5’ DNA外切酶活性 外切酶活性 特点： 特点： 活性在pH9左右(20℃)和温度 ℃左右的反应条件下最 左右( ℃ 和温度75 活性在 左右 处理后仍保持活性；

高，95 ℃处理后仍保持活性； 即使100 ℃处理 处理5min,仍具一半活性 即使 ，

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聚合酶(有校对功能 ②Pwo DNA聚合酶 有校对功能 聚合酶 有校对功能)功能： 功能： 聚合酶活性， 有5’ →3’DNA聚合酶活性，3’→ 5’ DNA外切酶活性 聚合酶活性 外切酶活性 无5’ →3’DNA外切酶活性 外切酶活性 特点： 特点： 耐热性更高， 处理2h,仍具一半活性； 耐热性更高， 100 ℃处理 ，仍具一半活性； 更高 准确度比 聚合酶高10倍 准确度比Taq DNA聚合酶高 倍； 聚合酶高 扩增的DNA片段是平末端的。 片段是平末端 扩增的 片段是平末端的

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聚合酶(RT-PCR) ③Tth DNA聚合酶 聚合酶功能： 功能： 有强5’ →3’DNA聚合酶活性； 聚合酶活性； 聚合酶活性 无3’→ 5’ DNA外切酶活性 外切酶活性 特点： 特点： Mn2+存在时，有强反转录酶活性，RNA → cDNA 存在时，有强反转录酶活性， 反转录酶活性 Mg2+存在时，cDNA可继续进行 存在时， 可继续进行PCR扩增 可继续进行 扩增 反转录-聚合酶链式反应 ),扩 可被用于反转录 聚合酶链式反应( ), 可被用于反转录 聚合酶链式反应(RT-PCR),扩 增至少1000bp长的 长的cDNA片段 增至少 长的 片段

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④C.therm. DNA聚合酶 聚合酶 (RT-PCR、有校对功能 、有校对功能)功能： 功能： 聚合酶活性； 有5’ →3’DNA聚合酶活性；3’→ 5’ DNA外切酶活性 聚合酶活性 外切酶活性 特点： 特点： Mg2+存在时，有反转录酶活性，RNA → cDNA 存在时， 反转录酶活性 活性， 合成cDNA的准确度比 合成 的准确度比Tth DNA聚合酶高 倍 聚合酶高2倍 的准确度比 聚合酶高

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Taq DNA聚合酶，Pwo DNA聚合酶 聚合酶， 聚合酶 聚合酶 将喜温性细菌中此酶的基因转入E.coli细胞， 将喜温性细菌中此酶的基因转入 细胞， 细胞 市售产品为此酶基因在E.coli细胞中的表达 市售产品为此酶基因在 细胞中的表达 产物。 产物。 Tth DNA聚合酶，C.therm. DNA聚合酶 聚合酶， 聚合酶 聚合酶 直接从发现它们的微生物中提取

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2、靶 DNA 和模板 、 双链片段。 靶 DNA:待扩增的特定 ：待扩增的特定DNA双链片段。 双链片段 应该知道其两端20 的核苷酸序列， 应该知道其两端 ~30bp的核苷酸序列， 的核苷酸序列 供设计一对引物之用。 供设计一对引物之用。

模板：一条单链的DNA片段 模板：一条单链的 片段

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3、PCR引物 、 引物(Primer) 引物– PCR扩增引物：是指与待扩增 扩增引物： 扩增引物 是指与待扩增DNA区域两 区域两 端序列互补的人工合成的寡核苷酸短片段， 端序列互补的人工合成的寡核苷酸短片段， 其长度通常在16~ 个核苷酸之间 个核苷酸之间。 其长度通常在 ~24个核苷酸之间。它包括 引物1和引

物 和引物2。 引物 和引物 。 – 引物设计的基本原则是最大限度地提高扩增 引物设计的基本原则是最大限度地提高扩增 效率和特异性， 效率和特异性，同时尽可能抑制非特异性扩 增。

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具体的设计原则： 引物 端必须具有游离-OH基团； 引物3’端必须具有游离 基团； 端必须具有游离 基团 引物长度 引物长度20-30个核苷酸，G+C含量一般为 个核苷酸， 含量一般为40%~60%,四 个核苷酸 含量一般为 ， 种碱基的分布最好随机，不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在； 种碱基的分布最好随机，不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在； 引物应避免回文结构，同时引物之间也不能有互补性 ， 引物应避免回文结构， 避免形成引物二聚体； 避免形成引物二聚体； 5’端可以修饰，如加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、 端可以修饰，如加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、 端可以修饰 地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。 地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能 端绝对不能 进行任何修饰，因为引物 …… 此处隐藏：2052字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……