3_5_二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量的研究

3_5_二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量的研究

534 2008, Vol. 29, No. 08

食品科学※分析检测

３，５－二硝基水杨酸比色法测定

还原糖含量的研究

赵　凯，许鹏举，谷广烨

（哈尔滨商业大学食品工程学院，食品科学与工程省级重点实验室，黑龙江　哈尔滨　　　　　　１５００７６）

摘　　　要：比较了两种ＤＮＳ试剂测定还原糖含量的影响因素。探讨了试剂添加量、显色时间、测定波长以及显色后存放时间对测量结果的影响。结果表明，ＤＮＳ试剂的用量１．５ｍｌ，沸水浴显色时间５ｍｉｎ，显色定容３０ｍｉｎ后，分别在５４０ｎｍ和５５０ｎｍ波长条件下测定，数据的准确性和稳定性较好。关键词：３，５－二硝基水杨酸（ＤＮＳ）；还原糖；比色法；测定条件

Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅｄｕｃｉｎｇ　Ｓｕｇａｒ　Ｃｏｎｔｅｎｔ　Ｕｓｉｎｇ　３，５－Ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｍｅｔｈｏｄ

ＺＨＡＯ　Ｋａｉ，ＸＵＥ　Ｐｅｎｇ－ｊｕ，ＧＵ　Ｇｕａｎｇ－ｙｅ

（Ｐｒｏｖｉｎｃｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　Ｈａｒｂｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ

Ｃｏｍｍｅｒｃｅ，　Ｈａｒｂｉｎ　　　　　　１５００７６，　Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｗｏ　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　３，　５－ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　（ＤＮＳ）　ａｇｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｄｕｃｉｎｇ　ｓｕｇａｒｃｏｎｔｅｎｔ，　ａｎｄ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｆａｃｔｏｒｓ，　ｓｕｃｈ　ａｓ　ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　ＤＮＳ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ｔｉｍｅ，　ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ　ａｎｄｓｔｏｒａｇｅ　ｔｉｍｅ　ｗｅｒｅ　ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｒｅａｇｅｎｔ　ａｍｏｕｎｔ　ａｒｏｕｎｄ　１．５　ｍｌ，　ｂｏｉｌｉｎｇ　ｂａｔｈ　ｔｉｍｅ　ｎｏｔｌｅｓｓ　ｔｈａｎ　５　ｍｉｎｕｔｅｓ，　ａｎｄ　ｓｔａｎｄｉｎｇ　ｆｏｒ　３０　ｍｉｎｕｔｅｓ　ａｆｔｅｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ，　ａｔ　ｔｈｅ　ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　５４０　ｎｍ　ａｎｄ　５５０　ｎｍ　ｆｏｒ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｏｎｅ　ａｎｄｔｗｏ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，　ｔｈｅ　ａｃｃｕｒａｔｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｃａｎ　ｂｅ　ａｃｑｕｉｒｅｄ．

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：３，　５－ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　（ＤＮＳ）；ｒｅｄｕｃｉｎｇ　ｓｕｇａｒ；ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ；ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ

中图分类号：　ＴＳ２３１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　文献标识码：Ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　文章编号：１００２－６６３０（２００８）０８－０５３４－０３

３，５－二硝基水杨酸（ＤＮＳ）比色法是还原糖测定的一

种常用方法。该方法具有简便、快速、灵敏度高等特点；同时，通过该方法测定还原力，还可以用于判断普鲁兰酶（ｐｕｌｌｕｌａｎａｓｅ）等脱支酶对淀粉的脱支效果。但在采用该方法进行测定时，不同文献介绍的测定条件有较大差异［１－５］，从而影响了测定结果的准确性和可比性。本实验对ＤＮＳ比色法测定条件进行探讨，指出影响分析测定的关键因素，使测定结果更具准确性和可比性，以利于实际采用该方法进行相关分析测定时参考应用。１１．１

材料与方法材料与试剂

玉米淀粉　　　　黑龙江龙凤玉米开发有限公司。

收稿日期：２００－０４－２５

普鲁兰酶（酶活１０００ＡＳＰｕ／ｇ）　　　　美国杰能科公司；３，５－二硝基水杨酸、氢氧化钠、丙三醇、苯酚、亚硫酸钠、酒石酸钾钠、葡萄糖、醋酸钠、冰乙酸，以上药品为分析纯。１．２

仪器与设备

ＳＰ－７２１Ｅ型可见分光光度计　　　　上海光谱仪器有限公司；Ａｃｃｕｌａｂ精密电子天平；７０２－型电热鼓风箱　　　　大连干燥箱厂；　ＤＺＦ－６０５０型真空干燥箱　　　　上海博迅实业有限公司医疗设备厂；ＴＨＺ－８２Ａ水浴恒温振荡器　　　　江苏荣华仪器制造有限公司；８０－２离心机　　　　上海浦东物理光学仪器厂；ＨＨ－４数显恒温水浴锅　　　　国华电器有限公司。１．３１．３．１

方法

ＤＮＳ试剂配制

试剂１：称取３．２５ｇ　３，５－二硝基水杨酸溶于少量水

基金项目：黑龙江省“十一五”重大攻关项目（ＧＡ０６Ｂ４０１－４）；黑龙江省教育厅项目（１６０２０４）；　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　黑龙江省博士后基金项目（ＬＢＨ－Ｚ０５０３７）

3_5_二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量的研究

※分析检测食品科学

2008, Vol. 29, No. 08535

中，移入５００ｍｌ容量瓶，加２ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液１６２．５ｍｌ，再加入２２．５ｇ丙三醇，摇匀，定容至５００ｍｌ，储存于棕色瓶放置在冰箱中待用［１］。

试剂２：称取２．５ｇ　３，５－二硝基水杨酸溶于少量水中，加入０．５ｇ苯酚，再溶解０．０７５ｇ亚硫酸钠、２．５ｇ氢氧化钠和５０ｇ酒石酸钾钠，移入５００ｍｌ容量瓶，摇匀，定容至５００ｍｌ，储存于棕色瓶放置在冰箱中待用１．３．２

葡萄糖标准液配制

［２］

ＤＮＳ试剂，混匀并作空白，沸水浴加热５ｍｉｎ，流水冷却、定容。以相同条件下不加葡萄糖标液作空白溶液，波长５４０ｎｍ下测定吸光度。２２．１

结果与分析

测定波长的选择

ＤＮＳ法即３，５－二硝基水杨酸比色法的测定原理是３，

。

称取大于１ｇ的葡萄糖置于热风干燥箱９８℃干燥至恒重，准确称取１．０００ｇ葡萄糖，用蒸馏水溶解并定容至１０００ｍｌ。分别按表１进行配置操作，充分混匀后于沸水浴中加热煮沸５ｍｉｎ。流水冲冷却后再分别向各试管中加入蒸馏水４ｍｌ，混匀。以管１为空白对照，５４０ｎｍ波长下测各管的吸光度。绘制吸光度－葡萄糖浓度曲线。

表１　　葡萄糖标准溶液的配制

Table 1 Preparation of standard glucose solution管号

１ｍｇ／ｍｌ葡萄糖溶液（ｍｌ）

蒸馏水（ｍｌ）ＤＮＳ试剂（ｍｌ）

１００．５１．５

２０．１０．４１．５

３０．２０．３１．５

４０．３０．２１．５

５０．４０．１１．５

６０．５０１．５

５－二硝基水杨酸在中性或偏碱性条件下与多糖水解的还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物——３－氨基－５－硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈正比。文献［３－５］中关于ＤＮＳ法的测定波长有５４０、５２０、４９０ｎｍ等各不相同，为了进一步确定ＤＮＳ法在测定还原力过程中的最佳波长，考虑相关因素进行波谱扫描，结果如图１、２所示。

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