儿童流感的临床特征分析和Toll样受体3基因多态性与儿童流感遗传(3)

临床上发现，不同的患者之间，流感的发病和病情严重程度差异明显，有的患者只是普通流感，能在短时间内能够自愈或临床痊愈，而有些患者逐步甚至起病时就出现重要器官的功能衰竭即重症流感，甚至死亡。在Albright等[6]对因流感而死亡的患者亲属和死亡患者配偶的亲属的研究中发现，流感死亡患者亲属的相对危险度都要高于其配偶亲属的相对危险度，这提示遗传易患因素可能是导致流感患者死亡的危险因素之一。尽管如此，研究发现，甲型流感（H5N1）患者具有家族聚集性的特点，少数高度暴露者（如家禽捕杀人员）的发病也提示在流感的发病机制中，除了病毒毒力、暴露因素之外，遗传背景可能在甲型流感病毒H5N1感染中发挥着重要的作用[7,8,9]。在2009年H1N1流感大流行后，WHO把流感的遗传易感性作为优先研究项目之一[10]。而在一般人群中，5岁以下儿童为重症流感的高危人群之一[11]。

因此，儿童流感的临床特征是值得密切关注的问题，而且，在儿童人群中开展流感遗传易感性和病情严重性的相关研究也尤为重要。目前关于流感的遗传易感性和病情严重性方面的研究主要集中于单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism ，SNP），SNP是一类遗传标记，它是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，这种在基因水平上的改变可能引起基因表达的差异以及所编码的功能蛋白质的不同，从而影响流感的表型、预后以及对药物的反应。

TLR（Toll样受体）是存在于机体免疫细胞上的识别受体，在流感病毒感染中具有重要作用。TLR3广泛分布于树突状细胞（DC），表达于细胞质膜的表面和胞内溶

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前言

酶体中，可识别病毒核酸及内吞体内的核酸，研究认为，TLR信号通路的过度活化和调节失常与流感的发病有关，尤其是TLR3信号通路[12,13]。TLR3信号通路包括两条途径，即MyD88依赖性途径和非依赖性途径。在MyD88依赖性途径中,当流感病毒同TLR3结合后可促使受体发生二聚化，其胞质区通过TIR结构域募集MyD88，结合后引发的下游事件主要包括以下几个方面:(1)MyD88通过与TIR区结合，作为接头蛋白募集IRAK(IL-1受体相关激酶); (2)IRAK结合TNF受体相关因子6(TRAF6)从而活化TAK1;(3)TRAF6活化引起两条不同途径的信号转导:一条包括p38MAPK家族和c-Jun N-端激酶Jnk;另一条是包括Rel家族转录因子NF-κB的途径，诱导炎症细胞释放炎症因子并介导炎症反应。在MyD88非依赖性途径中，胞内段TIR结构域直接结合转接蛋白(TRIF)，TRIF活化干扰素调节因子3( IRF3),诱导I型干扰素、CD80、CD86和IP-10等抗病毒性细胞因子的表达，并参与诱导DC的分化成熟以及抗病毒免疫反应。因此，TLR3与流感病毒的感染相关，TLR3的表达异常或结构功能异常可能对流感病毒的识别和进一步信号传递造成影响，从而引起异常的免疫应答。

TLR3基因位于第四号染色体长臂（4q35区），开放读码区有四个外显子编码，目前已有研究表明[14]，发现TLR3 rs5743313 C/T和TLR3 rs5743315 A/C多态性引起的氨基酸改变可导致TLR3受体细胞外域发生改变，影响Toll样受体信号传导和炎症介质的生成，可能使机体更易感染流感病毒。Esposito等[14]对51例H1N1阳性的流感患儿和221例H1N1阴性的有流感样症状的患儿进行了基因研究，发现TLR3 rs5743313C/T多态性与流感肺炎相关，而TLR3rs5743315A/C多态性可能在流感导致的肺炎中起到重要作用。Hidaka等[15]在1例流感相关性脑病的患者中发现TLR3（F303S）的错义突变，表明TLR3基因（F303S）的突变可能与重症流感并发症相关。Liu等[16]对模式识别受体在H1N1流感病毒感染中的作用进行了研究，利用RT–PCR和ELISA方法检测TLR基因的表达，发现在流感病人中TLR3基因的表达增加，表明TLR3是先天性免疫和固有免疫中重要的识别受体。

虽然上述研究表明，TLR3的基因多态性与与流感易感性和病情严重性存在关联，但目前国内尚无相关的研究。本课题即从单核苷酸多态性的角度，通过检测和分析流感患儿TLR3基因多态性，探讨TLR3基因多态性与儿童流感的遗传易感性、病情严重性的关系，并期望为流感的预防、诊治提供新的思路。

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广州医科大学硕士学位论文

第一部分儿童流感的临床特征分析

资料与方法

1.资料

1.1研究对象

2013年3月至2013年5月期间，我院（广州市妇女儿童医疗中心）收治入院的符合《流行性感冒诊断与治疗指南（2011年版）》诊断标准的86例流感患儿作为病例组，男57例，女29例，男女比例约为2:1，其中年龄最小1月，最大7岁，平均

3.2岁。

1.2诊断标准

1.2.1流感诊断标准：参照《流行性感冒诊断与治疗指南（2011年版）》[11]中的

诊断标准。

入组标准：①年龄小于14岁；②发热伴咳嗽、流涕等急性上呼吸道症状；③流感病毒核酸检测结果为甲型或乙型流感病毒阳性。④家长签署知情同意书（附录1）。

排除标准：①自身免疫性疾病的患儿；②采血前1个月内应用皮质激素或者免疫抑制剂治疗的患儿；③肿瘤患儿；④近期接受化疗或放疗的患儿；⑤慢性肺部疾病和心血管系统等基础疾病患儿；⑥入院后痰或血液的细菌培养阳性的患儿；⑦非汉族儿童。

1.2.2轻症组入组标准：仅有发热、咳嗽、流涕等急性上呼吸道感染症状者，排

除任一重症病例组入组标准。

1.2.3重症组入组标准：流感病例出现下列1项或1项以上情况者为重症流感病

例：（1）神志改变：反应迟钝、嗜睡、躁动、惊厥等；（2）呼吸困难和/或呼吸频率加快：5岁以上儿童＞30次/min；1岁-5岁＞40次/min；2月龄-12月龄＞50次/min；

新生儿-2月龄＞60次/min；（3）严重呕吐、腹泻，出现脱水表现；（4）少尿：小儿尿量＜0.8 ml/kg/h，或每日尿量婴幼儿＜200ml/m2，学龄前儿＜300ml/m2，学龄儿＜400ml/m2；或出现急性肾功能衰竭；（5）低血压灌注标准见1.2.4；（6）动脉血氧分压（PaO2）＜60 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）或氧合指数（PaO2/ FiO2）＜300(补充

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第一部分儿童流感的临床特征分析

低氧血症评估标准见1.2.5)；（7）胸片显示双侧或多肺叶浸润影，或入院48小时内肺部浸润影扩大≥50%；（8）肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）等酶水平迅速增高；（9）原有基础疾病明显加重，出现脏器功能不全或衰竭。

1.2.4各年龄组低血压灌注标准参照《国际儿科脓毒症定义会议介绍》[17]：见表1。

1.2.5低氧血症评估标准[17]：证明需要高氧或FiO2>0.5始能维持氧饱和度≥92%。

表1.各年龄组低血压灌注标准

年龄组收缩压（mmHg）

～1周＜65

～1月＜75

～1岁＜100

～6岁＜94

～12岁＜105

2.方法

2．1病原学检测

通过咽拭子采集呼吸道分泌物标本，采用RT-PCR进行流感病毒RNA检测，检测仪器为PTC-200PCR仪，操作按广州华银医药科技有限公司生产的甲、乙型流感病毒核酸诊断试剂盒说明进行。

（1）甲、乙型流感病毒核酸诊断试剂盒主要组成成分，如表2。

表2甲、乙型流感病毒核酸诊断试剂盒主要组成成分

成分用量

RNA抽提A液10ml×1瓶

RNA抽提B液12.5ml×1瓶

RNA抽提C液10ml×1瓶

样本稀释液1.0ml×2支

RT-PCR反应液1.0ml×1支

Taq酶12μl×1支

反转录酶25μl×1支

强阳性对照1份

阴性对照0.12ml×1支

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