基因打靶与RNA干扰技术在丝状真菌基因功能组学研究中的应用(3)

２．３．１

设计ｓｉＲＮＡ序列ＲＮＡｉ成功的关键就在于ｓｉＲＮＡ能否与目的ｍＲＮＡ特异地结合并将其有效地分解，因此确保ｓｉＲＮＡ序列高度同源于靶基因而绝不与其他基因同源，是ｓｉＲＮＡ设计的基本原则。目前，设计ｓｉＲＮＡ序列主要有两种方法：根据文献的报道，使用已经确定的ｓｉＲＮＡ序列；也可以根据ｓｉＲ—ＮＡ序列设计软件输入靶基因序列，进行比对后，选择其提供的若干个序列，以筛选特异性较好的序列进行试验。

２．３．２

获得产物ｓｉＲＮＡ目前获得ｓｉＲＮＡ常用的

方法包括以下几种：（１）化学合成法：主要适用于目前已知最有效的ｓｉＲＮＡ，并且需要大量ｓｉＲＮＡ进行研究的情况。（２）体外转录法：利用盯ＲＮＡ聚合酶体外转录ＤＮＡ，直接产生小片段的ｄｓＲＮＡ，然后使用Ｄｉｃｅｒ酶消化，产生短的ｓｉＲＮＡ。此法主要用于筛选ｓｉＲＮＡｓ，特别是需要制备多种ｓｉＲＮＡｓ。（３）长片段ｄｓＲＮＡｓ酶解法：以２００一ｌ０００个碱基的靶ｍＲ—ＮＡ为模板，用体外转录的方法制备长片段双链ｄｓＲＮＡ，然后用ＲＮａｓｅＩＩＩ／Ｄｉｃｅｒ酶在体外消化得到ｓｉＲＮＡｓ混合物。由于含有不同的ｓｉＲＮＡｓ，通常能够保证目的基因被有效地抑制，提高了成功率，故目前应用较多。此法适用于重点研究某个基因功能的缺失。（４）ｓｉＲＮＡ表达载体法：使用质粒载体或者病毒载体合成。前者首先要合成具有发卡结构的ＤＮＡ，构建到含有ｕ６或Ｈ１启动子的质粒中，将之转入细胞，在下游启动子的作用下转录生ｓｉＲＮＡ；后者主要是在病毒骨架上进行转录。目前成功的有通过构建表达ｄｓＲＮＡ的载体ＰＴｚＵ６＋１，ＰＴｚｕ６＋２１等进行转染，具有稳定性高等优点。此法主要适用

万方数据

于已知一个有效的ｓｉＲＮＡ序列，需要维持较长时间的基因沉默，或者需要用抗生素筛选能表达ｓｉＲＮＡ的细胞的情况。这是众多方法中唯一可以进行长期研究的方法——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达。（５）ＰＣＲ方法构建ｓｉＲ—ＮＡ表达框架（ｓｉＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃａｓｓｅｔｔｅｓ，ｓＥｃｓ）：应用ＰｃＲ法构建含有特定的启动子和终止子及靶序列的表达元件，之后转染入细胞中使得ｓｉＲＮＡ进行表达。此法适用于筛选ｓｉＲＮＡ序列或在克隆到载体前筛选最佳启动子。

２．３．３

ｓｉＲＮＡ转染将足量的ｓｉＲＮＡ转染入细胞

是决定ＲＮＡｉ成败的又一关键步骤。在转染的过程中有以下几点需要注意：（１）针对不同的靶细胞类型，选择不同的转染试剂并优化转染步骤，对ｓｉＲＮＡ试验的成功至关重要。尽量选择专门针对ｓｉＲＮＡ的高效、低毒转染试剂；（２）同时设置阳性对照以确认整个试验体系的有效性，阴性对照以排除非特异沉默现象；（３）由于ｓｉＲＮＡ的纯度直接关系到转染效率和沉默效率，故ｓｉＲＮＡ转染需要选用高纯度的

ｓｉＲＮＡ。

２．３．４

ＲＮＡｉ效果检测ＲＮＡｉ的效果可从ｍＲＮＡ

和蛋白质两方面进行分析。ｍＲＮＡ水平：应用ＲＴ—ＰｃＲ、定量ＰＣＲ和Ｎｏｒｔｈｅｍ杂交等方法检测ｍＲＮＡ的转录水平；蛋白质水平：应用Ｗｅｓｔｅｍ杂交、ＥＬＩＳＡ和免疫荧光等方法检测蛋白表达量。此外，细胞的代谢过程、生理生化系数等表型参数的变化也是ＲＮＡｉ效果最终和最大的体现。

２．４

ＲＮＡｉ技术的特点

ＲＮＡ干扰技术本身具有以下特点：（１）由于ｓｉＲＮＡ序列作用的范围比较大，２１—２３ｎｔ中任何一个核苷酸的改变，都会影响ｓｉＲＮＡ对靶标ｍＲＮＡ的作用，故可应用于抑制单个核苷酸突变的基因表达。（２）试验周期短，一般抑制靶基因表达４８ｈ后就可以对其生物学现象进行分析。（３）只有针对编码区的ｄｓＲＮＡ才能产生有效和特异性地干涉，针对内含子区域的ｄｓＲＮＡ序列则不能产生，并且选择靶序列应避免高度同源序列之间的交叉干扰，故ＲＮＡｉ的靶序列需慎重选择。（４）ＲＮＡｉ的效率还受到ｄｓＲ．ＮＡ的长度的影响嵋…。

此外，与基因敲除相比，将ＲＮＡ干扰技术应用

分子克隆技术及小蛋白电泳

２０１１年第５期冀颖等：基因打靶与ＲＮＡ干扰技术在丝状真菌基因功能组学研究中的应用

６９

于丝状真菌基因功能的研究，还有以下优势：（１）ＲＮＡ干扰是在ｍＲＮＡ水平上起作用，这样基因沉默的成功率将不受多合体中多拷贝基因或非转化核苷酸的影响。（２）对于一些看家基因，如果直接突变将会造成致死性，但通过ＲＮＡ干扰技术下调其启动子的表达来达到抑制此基因表达的作用就可以避免这一缺陷¨０１。（３）通过诱导启动子或者组织特异性启动子还可以实现真菌特定生活阶段或特异性组织的基因沉默，并且可以据此跟踪此基因在不同时期不同组织的表达情况。

虽然，基因沉默技术有许多优势，但也有一些局限性。例如对于不同基因，要达到表型差异所需要的表达量不同，而ＲＮＡｉ技术并不都能达到引起差异的水平。因此，应用此技术并不一定产生表型上的差异，这就给突变效果的检测带来了困难。此外，采用基因沉默而产生的基因突变，不可以进行基因回救，这也是限制其广泛应用的一个瓶颈。

３

展望

随着大量真菌基因组序列信息的测定，基因功

能的研究将成为基因组计划完成后的重大课题，阐明基因功能逐渐成为研究热点，而如何选择适宜的基因功能研究方法无疑是真菌基因功能组学研究的一个决定性因素。这就要求研究者们在实际工作中，根据特定基因制定特定的基因功能研究方案，以对其功能进行快速、全面和系统的研究。相信在不久的将来，人类将全面了解生物基因组的功能，乃至其在整个生命过程中的相互作用。

参考文献

［１］Ｄ∞ｔｓｃｈｍａｎＴ，Ｇｒｅ鹊ＲＪ，Ｍａｅｄａ

Ｎ，ｅｔ

ａ１．Ｔａｒｇｅｔｔｅｄｃｏｎｅｃｔｉｏｎｏｆ

ａ

ｍｕｔａｎｔＨＰＲＴｇｅｎｅｉｎ

ｍｏｕ８ｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃ

ｓｔｅｍ

ｃｅＵｓ．Ｎａｔｕ他，１９８７，

３３０：５７６－５７８．

［２］ＰｅｂｅｒｄｙＪＦ，ｃａｔｅｎ

ｃＥ，ＯｇｄｅｎＪＥ，ｅｔａ１．Ａｐｐｌｉｅｄｍｏｌｅｃｕｌ盯ｇｅｎｅｔｉｃｓ“

ｆｕｎｇｉ［Ｍ］．Ｎｅｗ

Ｙｏｒｋ：Ｐｒｅ９８

ｓｙｎｄｉｃａｔｅ“ｔｈｅｕｎｉｖｅ玛ｉｔｙ“ｃａｍ—

ｂｒｉｄｇｅ，１９９１．

［３］ｓｈｅｎｗＦ，ｗｅｎｇ

ＨＢ，ＮｉｕＢＬ，ｅｔ

ａ１．ＡｇｒＤ６伽把＾Ⅱｍｔ“肌扣ｃ拓ｍ—ｍｅｄｉ一

砒ｅｄ

ｔ瑚ｓｆ０珊ａｔｉｏｎ

ｏｆ

ｔＩｌｅ

ｐａｔｈｏｇｅｎ

ｏｆ口ＤＩｒｙｔ矗ｃｉｎ删口．Ｈｅｒｃｄｉｔａｓ，

２００８，３０（４）：５１５－５２０．

［４］ＹｕＪＨ。Ｈ咖柚ｚ，Ｈａｎ

ＫＨ，ｅｔ

ａ１．Ｄｏｕｂｌｅ—ｊｏｉｎｔ

ＰｃＲ：ａＰｃＲ－ｂａｓｅｄ

ｍｏｌｅｃｕｌａｒｔｏｏｌｆｏｒ

ｇｅｎｅ

ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ８ｉｎ

ｆｉｌ８ｍｃｎｔｏｕｓ

ｆｕｎｇｉ．ＦｕｎｇａｌＧｅｎｅｔ

Ｂｉｏｌ，２００４，４ｌ（１１）：９７３－９８１．

［５］李敏，杨谦．一种高效构建同源重组ＤＮＡ片段的方法一融合

万方数据

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