基因打靶与RNA干扰技术在丝状真菌基因功能组学研究中的应用

分子克隆技术及小蛋白电泳

生物技术通报

技术与方法

ＢＩｏＴＥｃＨＮｏＬｏＧＹ

ＢＵＬＬＥＴｌＮ

２０１１年第５期

基因打靶与ＲＮＡ干扰技术在丝状真菌

基因功能组学研究中的应用

冀颖

李梅蒋细良

（中国农业科学院植物保护研究所农业部生物防治重点开放实验室，北京ｌＯ００８１）

摘要：随着丝状真茵模式生物基因组测序工作的进行，其提供的大量未知功能的基因序列，为研究丝状真菌的基因

功能开辟了新的方向，并已成为生命科学领域研究的热点。对基因功能研究中最新的两种方法——基因打靶和ＲＮＡｉ技术的原理、技术路线和特点以及应用情况进行综述。

关键词：

功能基因组学

基因打靶

ＲＮＡｉ融合ＰＣＲ

ＡＴＭＴ

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随着大量丝状真菌基因序列信息的测定，以基因功能鉴定为目标的功能基因组学已经成为目前生命科学领域研究的热点。转基因、基因打靶和ＲＮＡ干扰等反向遗传学技术是系统地分析基因的功能、基因间的相互作用、基因组的时空表达以及发现和寻找新的功能基因的有效方法。其中基因打靶、ＲＮＡ干扰技术能够有效和特异性地抑制目标基因的表达，操作简单易行，故在基因功能研究中应用十分广泛。

构已知功能未知的基因，从分子水平设计试验，将该基因去除或者用其他序列相似的基因取代，从而定点突变靶基因，最后从整体观察目标生物，推测相应基因的功能。

１．１基因打靶技术的原理

此技术主要是应用同源重组（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ

ｒｅ．

ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，ＨＲ）原理，将转染的ＤＮＡ与细胞内的靶基因进行同源交换，以改变靶序列，从而研究其结构与功能或者进行基因治疗。应用此技术可以在分子水平上将目标基因进行定向修饰包括基因灭活、引入点突变、缺失突变和插入外源片段等，并将修饰后的遗传信息在生物体内表达，从而通过表型的变

１基因打靶技术

基因打靶技术是２０世纪８０年代末发展起来的一种新型的研究基因功能的技术。它是指对一个结

收稿日期：２０１０．Ｉｌ—１８

基金项目：国家自然科学基金项目（３０６７１４００），国家支撑项目（２００６ＡＤ０８Ａ０２），国家高技术研究发展计划（２００６ＡＡｌ０Ａ２１１），中国农业科学院

植物保护研究所基本科研业务费专项（２０ｌＯ－１５），植物病害生物学国家重点实验室开放基金（ＳＫＬ２０１００Ｐ１７）作者简介：冀颖，女，硕士研究生，研究方向：微生物学；Ｅ—ｍａｉｌ：ｊｉｎｇｌ９８６０３１９＠１２６．ｃｏｍ通讯作者：蒋细良，男，研究员。Ｅ—ｍａｉｌ：ｘＵｉａｎｇ＠ｃＭ８．ｎｅＬ

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万方数据

分子克隆技术及小蛋白电泳

２０１１年第５期

冀颖等：基因打靶与ＲＮＡ干扰技术在丝状真菌基因功能组学研究中的应用

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化揭示目标基因的功能。１．２基因打靶技术的技术路线

１９８５年，首次证实在哺乳动物细胞中存在基因同源重组，为基因敲除技术的创立奠定了理论基础。１９８７年，Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ等…成功地构建了动物一小鼠敲除模型，为基因敲除技术的应用奠定了实践基础。近２０年来，此项技术已经由在酵母和哺乳动物中的应用，拓展到了植物、真菌基因功能的研究中。其大致要包括构建载体、真菌转化、筛选突变体和分析表型等步骤。

１．２．１

构建打靶载体打靶载体由３部分组成，包

括两端与靶基因两侧同源的同源臂序列以及中间的选择性标记序列。

真菌中打靶载体的选择标记，通常采用营养选择性标记基因如ｐｙｒ４、ａｒｇＢ、ｔｒｐｃ和ａｍｄｓ等，以形成互补受体菌的营养缺陷型。由于工业丝状真菌中相应营养缺陷型作宿主很难获得，因此后来又开发出显性选择标记，主要是抗生素标记基因，典型的如潮霉素、新霉素或腐草霉素和氨基糖苷类抗生素Ｇ４１８等旧。，携带此类抗性基因的质粒均可转化到真菌中，并表现出选择性抗性。此外，对化合物苯菌灵显示抗性的一些Ｂ．微管蛋白突变基因，绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）近年来也被作为报告基因在丝状真菌基因工程中得以应用旧－。

通过基因重组进行基因敲除要求已知靶基因两侧的侧翼序列，但不同生物中所要求的侧翼序列长度不同。在酵母菌中，仅需要５０ｂｐ的同源臂序列，就可以完成与目标基因的融合；但对丝状真菌而言，则通常需要至少５００一１

０００

ｂｐＨｌ。这就要求将同

源臂序列与抗性基因序列融合的过程中，根据所需要的靶序列的长度，采用适宜的方法，以提高融合的效率。

早期，人们通常采用多次克隆，纯化等步骤构建基因替换盒。对于背景简单的靶基因而言，这种方法比较实用。但对于丝状真菌而言，要求扩增较长的同源序列，就需要多次克隆步骤，增加了序列扩增中碱基突变的可能性，导致克隆效率降低，因此需要

建立一种简单快速的构建打靶载体的技术——融合

ＰＣＲ技术应运而生。

融合ＰｃＲ又称为双接头ＰｃＲ”’，是一种基于

万方数据

ＰｃＲ技术的高效地构建打靶载体的方法。其原理是采用末端具有反向互补序列的引物进行ＰｃＲ，形

成具有互补链——“尾巴”的序列，从而依赖这段互

补序列，将同源臂序列和抗性基因序列连接起来。这样将省去多次克隆、酶切和连接等复杂的步骤，提高效率。

融合ＰｃＲ技术构建打靶载体通常需要３个连续的ＰＣＲ反应，第一轮Ｐ …… 此处隐藏：1897字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……