基因打靶与RNA干扰技术在丝状真菌基因功能组学研究中的应用(2)

ＹｕＨ

３实验室在敲除构巢曲霉功能基因时曾设计两

对引物进行扩增，发现巢式引物几乎可以１００％获得目的产物。此外，退火温度的选择，延伸时间的设定等也是重要的影响因素。

迄今为止，应用此种方法，已经成功地敲除了３类丝状真菌中的３１个基因。如２００４年，Ｙｕ等”１分别以ａｒｇＢ、ｐｙｒＧ为选择性标记与构巢曲霉、烟曲霉和禾谷镰刀菌中的目标基因的上下游序列相连，成功构建了７个突变体；２００７年，李敏等＂１利用此项技术成功将哈茨木霉中Ｂ一微管蛋白基冈的上下游序列与苯并咪唑抗性基因，潮霉素抗性基因融合在一起，成功地构建了敲除微管蛋白的打靶载体。

另一种基于ＰＣＲ技术的高效地构建打靶载体的方法是引入酶切位点，这种方法被称为连接介导ＰＣＲ。６１。这一方法主要是通过带有特定酶切位点的引物扩增靶基因的两侧序列，将产物回收后，用相同的限制性内切酶酶切，然后在连接酶的作用下将３条片段连接起来，最后用巢式引物扩增整个片段，从而进行后续操作。这样就减少了一次ＰｃＲ反应，但增加了一步酶切一连接反应。这种做法的优点在于减少了反复扩增中产生突变的可能，但是由于酶切一连接的过程中，酶切的效率是一个不确定因素，因此这两种方法各有利弊，在具体试验中可以采用不同的策略，以提高打靶载体构建的成功率。

１．２．２

打靶载体的真菌转化丝状真菌的ＤＮＡ转

化方法，如ｃａｃｌ：／ＰＥＧ介导的原生质体的转化法、基因枪转化法、电穿孑Ｌ转化法、限制酶介（ＲＥＭＩ）的转化法和根癌农杆菌介导（ＡＴＭＴ）的转化法等都已成功用于丝状真菌打靶载体的转化。其中农杆菌介导法同源重组效率较高，故在丝状真菌中应用较为

万方数据

广泛。与其他转化方法相比，ＡＴＭＴ法最大的特点在于真菌受体的选择比较灵活，可以是原生质体、菌丝、孢子或者菌体组织。这样就减少了制备原生质体等复杂的步骤，并且转化效率高，转化子遗传稳定性好，这就为其广泛应用带来了优势。自１９９５年，Ｂｕｎｄｏｃｋ等…首次成功将这一技术应用到酿酒酵母菌的遗传转化以来，到目前为止，已有２０多个种的真菌利用该方法成功地实现了遗传转化¨ｏ。１９９８年，ｄｅＧｒｏｏｔ等。９１首次利用ＡＴＭＴ法对丝状真菌（包

括里氏木霉ｎｉｃ＾ｏｄｅｍⅡＭｅｓ西等）进行转化，发现其

转化效率是ＰＥＧ／ｃａｃｌ：介导的原生质体转化法的６００倍。２００８年，乔建军等¨叫利用ＡＴＭＴ法成功地构建了烟曲霉的尿嘧啶缺陷突变体；龙朝钦等…１成功地构建了烟曲霉几丁质合成酶ｃｈｓＣ基因缺失突变体；马彦等¨２１构建了烟曲霉ｐｂｓ２基因的缺失突变体。虽然ＡＴＭＴ法成功地介导了多种真菌的转化，但是，影响根癌农杆菌介导真菌转化的效率的因素较多，不同根癌农杆菌菌株及不同的双元载体都直接影响着转化的成败。

１．２．３转化子的筛选根据选择性标记，通常是抗生素标记，如潮霉素、新霉素或腐草霉素等，或者营养缺陷型标记，如精氨酸等，对转化子进行筛选，找到假定转化子，然后采用ｓｏｕｔｈｅｍ杂交技术或者ＰｃＲ扩增选择性标记基因的方法进行验证。

１．２．４转化子的表型分析通常采用转化子与野生型对照的方式，观察表型差异，或者检测某些成分的含量变化，最终验证此基因的功能。

１．３

基因敲除的作用特点

基因敲除是以同源重组为理论基础的先进的转基因技术，它克服了随机整合带来的盲目性和偶然性的缺点，具有整合位点确定、精确，转移基因频率较高的优点，在生物体中通过目的基因克隆、序列改造、导人靶载体、同源重组和培育受体细胞等一系列连贯步骤成功地敲除某一基因，通过对表型的分析进而对基因的功能进行研究，为基因功能的分析开辟了一条新的有效途径。但是在基因敲除过程中，如果被破坏的只是染色体中靶基因的某一个或几个外显子而非该基因的整个编码区，残留的编码序列有可能获得新的未知的功能¨３１；而大规模的染色体片段删除导致其他基因的编码区或者调控元件的删

分子克隆技术及小蛋白电泳

２０１１年第５期冀颖等：基因打靶与ＲＮＡ干扰技术在丝状真菌基因功能组学研究中的应用

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除，从而造成多基因删除或者死表型¨“，这些将给表型分析带来麻烦。ＲＮＡ干扰技术是从ＲＮＡ水平抑制基因的表达，从而避免了这一问题。

２

ＲＮＡ干扰技术

ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）是将与靶

基因的ｍＲＮＡ同源互补的双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）导入细胞，特异性地降解该ｍＲＮＡ，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，属于转录后水平的基冈沉默（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ

ｇｅｎｅ

ｓｉｌｅｎｃｅ，ＰＴＧｓ）。

２．１

ＲＮＡ干扰技术的发现

１９９０年，Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ等【１纠在研究矮牵牛花（ｐ““．

ｎ缸＾ｙ６ｒｉｄ口）转导色素合成基因时首先发现了基因沉默现象。１９９２年，Ｒｏｍａｎｏ等一６ｊ研究粗糙链胞菌

（肫ｕｒｏｓｐｏｒ口ｃｍｓｓ口）时，在真菌中首次发现基因沉默

现象，当时被称为基因的压制（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）现象。１９９５年，Ｇｕｏ和ＫｅｍｐｈｅｕｓⅢｏ在研究秀丽线虫（Ｃ口ｅ—ｎｏ以口６ｄｎ诂ｅＺｅｇ口ｎ５）时也发现了基因沉默现象，并发现注入反义链ＲＮＡ可以阻断ｐａｒ．１基因的表达，但在对照中注入正义链ＲＮＡ也发生了类似的现象，这显然不能用反义ＲＮＡ的作用模式加以解释。直到１９９８年，Ｆｉｒｅ等、１引对基因沉默现象进行深入研究，发现注入与靶基因ｍＲＮＡ同源的双链的ＲＮＡ比单独注入单链ＲＮＡ有更高效的沉默作用，而且发现分别注入负／正义链ＲＮＡ能产生类似现象很可能是由于污染了少量的正／负义链ＲＮＡ。此后，人们将这一现象称为ＲＮＡ干扰。

随后，在真菌、拟南芥、线虫、锥虫、水螅、涡虫、果蝇、斑马鱼和小鼠等真核生物中发现都存在基因沉默机制，并有试验表明，ＲＮＡ干扰与植物中的共抑制、真菌中的基因抑制很可能有共同的分子机制。这说明在进化的早期阶段，生物可能就获得了这种机制，并且在对抗病毒的入侵、抑制转座子的活动以及生物体的发育和基因调控等方面都有重要的意义。

随着转基因技术的广泛应用，研究还发现转入的基因可被机体当作外源遗传物质诱导其自身沉默，其机制是通过转录后基因沉默（ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃ却

ｔｉｏｎａｌ

ｇｅｎｅ

ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ＰＴＧＳ）或共抑制（ｃｏｓｕｐｐｒｅｓ—

ｓｉｏｎ）作用引起同源基因的沉默。”１。这就为人类应用ＲＮＡ干扰技术研究基因功能提供了可能。

万方数据

２．２

ＲＮＡ干扰的作用机制

随着ＲＮＡｉ技术的不断发展，对其分子机制的

研究也一直是热点。随着研究的深入，科学家们对ＲＮＡ干扰的作用机制取得了初步的共识。

ＲＮＡ沉默存在两种既有联系又有区别的途径：

ｓｉＲＮＡ（ｓｍａＵｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅＲＮＡ）途径ｍｉＲＮＡ（Ｍｉｃｒｏ

ＲＮＡ）途径。前者ＲＮＡ产生干扰作用是以存在与目的基因同源的ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ．ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡ）为前提的，其作用机制包括两个主要的阶段：ａ起始阶段：加入的ｄｓＲＮＡ被Ｄｉｃｅｒ酶切割为２１—２３ｎｔ的 …… 此处隐藏：2255字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……