微生物学实验讲义 - 图文(9)

待灭菌的培养基、无菌水、已包好的培养皿、移液管、玻璃涂棒等及待灭菌空试管、锥形瓶等玻璃器皿。

（四）实验步骤 1. 灭菌操作

1）打开灭菌锅盖向锅内加水，向锅内加适量水(立式高压蒸汽灭菌锅从进水杯处加煮开过的水到量高水位的标示高度)。水量不足，灭菌锅易蒸干。

2）放入待灭菌物品

将待灭菌物品放入灭菌桶内，物品不要放得太紧和紧靠锅壁，以免影响蒸汽流通和冷凝水顺壁流入灭菌物品。

3）盖好锅盖

将盖上的软管插入灭菌桶的槽内，有利于罐内冷空气自下而上排出，加盖，上下螺栓口对齐，采用对角方式均匀旋紧螺栓，使锅密闭。

4）排放锅内冷空气及升温灭菌

打开放汽阀，加热(电加热或煤气加热或直接通入蒸汽)，自锅内开始产生蒸汽后3 min再关紧放汽阀(或喷出气体不形成水雾)，此时蒸汽已将锅内的冷空气由排气孔排尽，温度随蒸汽压力增高而上升，待压力逐渐上升至所需温度时，控制热源，维持所需压力和温度，并开始计时，一般培养基控制在121℃灭菌20 min；含糖等成分培养基控制在112℃灭菌30 min或115℃灭菌20 min，关闭热源，停止加热，压力随之逐渐降低。

5）灭菌完毕降温及后处理

待压力降至0时，慢慢打开放汽阀(排汽口)，开盖，立即取出灭菌物品。但在压力未完全降至0处前，不能打开锅盖，以免培养基沸腾将棉塞冲出；也不可用冷水冲淋灭菌锅迫使温度迅速下降。所灭物品开盖后立即取出，以免凝结在锅盖和器壁上的水滴弄湿包装纸或落到被灭菌物品上，增加染菌率。斜面培养基自锅内取出后要趁热摆成斜面，灭菌后的空培养皿、试管、移液管等需烘干或晾干。若连续使用灭菌锅，每次需补足水分；灭菌完毕，除去锅内剩余水分，保持灭菌锅干燥。

2. 无菌试验

可抽少数灭过菌的培养基置37℃恒温箱中培养24h，若无菌生长，即视为灭菌彻底，可保存备用。

高灭蒸汽灭菌注意事项：

灭菌时人不能离开工作现场，控制热源维持灭菌时的压力。压力过高，不仅培养基的营养成分被破坏，而且高压锅超过耐压范围易发生爆炸造成伤人事故。

（五）实验报告内容

说明高压蒸汽灭菌原理、适用范围。用简练方法表示操作过程及操作关键。

（六）思考题

1. 高压蒸汽灭菌的关键为什么是高温而不是高压？高压蒸汽灭菌前为什么要将灭菌

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锅内的冷空气排尽？灭菌时为什么人不能离开工作现场？灭菌完毕后什么情况下才可以打开锅盖取灭菌物品？

2. 染菌或接种有微生物的培养基或培养器皿为什么不能直接洗涤而需先经过高压蒸汽灭菌？培养皿或锥形瓶内含菌固体培养基灭菌后如何处理？

3. 对含糖(如含葡萄糖或乳糖等)培养基进行高压蒸汽灭菌时，应采用多大压力、多长时间灭菌为宜？

4. 对血清、噬菌体浓缩液、氨基酸溶液、维生素溶液、抗生素溶液能否进行高压蒸汽灭菌？应采用何种方法除菌为宜？

实验四 微生物的分离与纯化

纯种分离技术是微生物学中重要的基本技术之一。从混杂微生物群体中获得单一菌株纯培养的方法称为分离。纯种(纯培养)是指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。

为了生产和科研的需要，人们往往需从自然界混杂的微生物群体中分离出具有特殊功能的纯种微生物；或重新分离被其它微生物污染或因自发突变而丧失原有优良性状的菌株；或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组菌株。尽管所分离、纯化的菌种不同，但分离、筛选及纯化新菌种的步骤都基本相似。大致分为采样、富集培养、纯种分离和性能测定四个步骤。

采样：主要依据所筛选的微生物生态及分布概况，综合分析决定采样地点。

富集培养：根据所筛选菌种的生理特性，加入某些特定物质，使所需的微生物增殖，造成数量上的优势，限制不需要的微生物生长繁殖。对无特殊性能要求的菌，可省略此步。

纯种分离：可用10倍稀释平板分离法、涂布法、划线分离法、单细胞分离法等。 性能测定：可分初筛和复筛两步。

本章主要介绍细菌、放线菌、酵母菌、霉菌常见四大类微生物分离、纯化方法。 即使采用最现代的分离技术，人类生产和生活中现已开发利用的微生物尚未超过其存在量的1％。寻找和发现有重要应用潜力、具有新功能的微生物菌种资源，尚有待于不断提出新思路、新的筛选与分离方法的突破。

一、微生物的接种技术

（一）目的要求

了解无菌操作在微生物接种过程中的重要性。 掌握几种常用的微生物接种方法。

（二）基本原理

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微生物的接种技术是生物科学研究中的一项最基本的操作技术。由于目的不同，可采用不同的接种方法，如斜面接种、穿刺接种或三点接种等，以获得生长良好的纯种微生物。选择一种好的接种方法，对于微生物的分离、纯化、增殖和鉴别等都很重要。因接种方法的不同，常需采用不同的接种工具，如接种环、接种针、移液管和涂布棒等，它们的外形见图4－1。

为了确保纯种不被杂菌污染，在整个接种过程中，必须进行严格的无菌操作。 本实验就一些常规的微生物接种方法作一扼要介绍。

（三）实验材料 1. 菌种：

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）；大肠杆菌（Escherichia coli）；黑曲霉（Aspergillus niger）等。

2. 培养基：

肉汤蛋白胨斜面4支，肉汤蛋白胨培养液2支（或装三角烧瓶），半固体肉汤蛋白胨直立柱4支，马铃薯葡萄糖琼脂平板6只（配方见附表二）。

3. 接种工具：

接种环、接种针、移液管、滴管、涂布棒。 4.其它：

标签纸、打火机、酒精灯（或煤气灯）、镊子、橡皮滴头等。

（四）实验步骤

1. 斜面接种：斜面接种是从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种把它移接到另一支新鲜斜面培养基上的一种接种方法。具体操作如下：

（1）贴标签：接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期等。标签纸要贴在斜面的正上方，距试管口约2～3厘米的位置。

（2）点酒精灯（或煤气灯）：注意火焰不要过大，以免气流运动过速。

（3）接种：用接种环将大肠杆菌移接到贴好标签的试管斜面上。无菌操作程序见图4－2，现简述如下：

手持试管：在左手的食指、中指和无名指间分别夹上菌种和待接斜面（斜面向上），并斜放使之近水平状态。

旋松棉塞：先用右手将棉塞旋松，以便拔出。

取接种环：右手拿接种环（如握钢笔一样），在火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部位也过火灭菌。

拔棉塞：用右手的无名指、小指和手掌边先后拔出菌种管和待接试管的棉花塞（或试管帽），然后让试管口缓缓过火灭菌（切勿烧得过烫）。

冷却接种环：将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触菌种管的培养基（如斜面顶端）部分，使环冷却。

取菌种：待环冷却后轻轻沾取少量菌苔或孢子，然后将接种环移出菌种管。

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图附4－1 接种工具

1.接种针；2.接种环；3.接种铲；4.移液管；5.滴管；6－7.玻璃涂棒

图附4－2 斜面接种无菌操作程序

1.烧环；2.拔塞；3.移种；4.加塞；5.灭菌

接种：在火焰旁将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面培养基的底部向上作“Z” …… 此处隐藏：1985字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……