微生物学实验讲义 - 图文(12)

无菌水试管6支，按10－3～10－7顺序编号，放置试管架上。取无菌移液管一支，从移液管包装纸套中间撕口，将包装纸套分成上、下两段，去除上段包装纸套，在移液管上端管口装橡皮头，取出下段移液管纸套放置桌面；以右手拇指、食指、中指拿住移液管上端的橡皮头，将吸液端口及移液管外部表面迅速通过火焰2～3次，杀灭撕纸套时可能污染的杂菌，切忌不要用手指去触摸移液管吸液端口及外部。左手持锥形瓶底，以右手掌及小指、无名指夹住锥形瓶上棉塞，在火焰旁拔出棉塞(棉塞夹在手上，不能乱放在桌上)，将1m1移液管的吸液

端伸进振荡混匀的锥形瓶土壤悬液底部，用手指轻按橡皮头，在锥形瓶内反复吹吸三次（吹吸时注意第二次液面要高于第一次吹吸的液面），然后准确吸取1 m1 10－2土壤稀释液，右手将棉塞插回锥形瓶上，左手放下锥形瓶，换持一支盛有9 ml无菌水试管，依前法在火焰旁拔除试管帽(或棉塞)，将1 m1 10

－2

土壤稀释液注入9 m1无菌水试管内，制成10

－3

的土壤稀

释液，将此移液管在试管内反复吹吸三次，然后取出移液管，并将其通过火焰再插入原来包装移液管的下段纸套内，以备再用。盖上试管帽，右手持l0－3稀释液试管在左手上敲打20～30次，混匀土壤稀释液。再从纸套取出原来的移液管，插入稀释液已混匀的试管内，再吹吸三次，然后准确吸出1 m1 10－3的稀释液，置第二支装有9 ml无菌水试管中，制成10－4土壤稀释液。用同法再制成10、10、10

－5

－6

－7

的土壤稀释液(为避免稀释过程产生误差，进

行微生物计数时，最好做每一个稀释度更换一支移液管)。最后用毕的移液管重新放入纸套内。待灭菌后，再洗刷或将用过的移液管放在废弃物筒中，用3％～5％来苏尔水浸泡1h后再灭菌洗涤。

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图4－5 稀释分离无菌操作示意图

1.从包装纸套中取出无菌移液管；2.安装橡皮头，勿用手指触摸移液管； 3.火焰旁取出土壤悬浮液；4.灼烧试管口及移液管吸液口；5.在火焰旁对试管中土壤悬浮液进行稀释；6.用手掌敲打试管，混匀土壤稀释液；7.从最小稀释度开始，将稀释液加入无菌培养皿中；8.将融化冷凉至45～50℃培养基倒入培养皿内；9.用毕的移液管装入废弃物缸中浸泡消毒后灭菌洗涤。

倾注法分离：取无菌培养皿6～9个，分别于培养皿底面按稀释度编号。稀释完毕后，可用原来的移液管从菌液浓度最小的10方法分别吸取1m1 10、10

－6

－5

－7

土壤稀释液开始吸取1ml稀释液，按无菌操作技

－6

－5

术加到相应编号10－7的无菌培养皿内。再以相同

的土壤稀释液，各加到相应编号为10、10

的无菌培养皿

内。将己灭菌的肉膏蛋白胨固体培养基融化，待冷却至45～50℃左右，分别倾入到已盛有10－5、10－6、10－7土壤稀释液的无菌培养皿内。注意：温度过高易将菌烫死，皿盖上冷凝水太多，也会影响分离效果；低于45℃培养基易凝固，平板易出现凝块、高低不平。倾倒培养基时注意无菌操作，要在火焰旁进行。左手拿培养皿，右手拿锥形瓶底部，左手同时用小指和手掌将棉塞拨开，灼烧瓶口，用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾入培养基约12～15m1，将培养皿在桌面上轻轻前后左右转动，使稀释的菌悬液与融化的琼脂培养基混合均匀，混匀后静置桌上。整个操作过程见图4－5，4－6。

培养：待平板完全冷凝后，将平板倒置于30℃恒温箱中，培养24～48h后，观察结果。 2）放线菌的分离

制备土壤稀释液：称取土样l g，加入到一个盛有99 ml无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中，并加入10滴l0％的酚溶液(抑制细菌生长)，有时也可不加酚。振荡后静置5min，即成10

～2

土壤稀释液。

倾注法分离：按前法将土壤稀释液分别稀释为10－3、10－4、10－5三个稀释度，然后用无菌移液管依次分别吸取1m1 10－5、10－4、10－3土壤稀释液于相应编号的无菌培养皿内，用高氏合成1号培养基依前法倾倒平板，每个稀释度做2～3个平行皿。

培养：冷凝后，将平板倒置于28℃恒温箱中，培养5～7d后观察结果。

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图4－6 稀释分离过程示意图

3）霉菌的分离

制备土壤稀释液：称取土样5g，加入到一个盛有95 m1无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中，振荡10 min，即成10－2土壤稀释液。

倾注法分离：依前法将土壤稀释液再稀释成10－3、10－4的土壤稀释液。然后用无菌移液管分别吸取1m1 10－4、10－3、10－2土壤稀释液于相应编号的无菌培养皿内。采用马铃薯培养基倾倒平板，为了抑制细菌生长和降低菌丝蔓延速度，马铃薯培养基临用前需无菌加入孟加拉红、链霉素和去氧胆酸钠。每个稀释度作2～3平行皿。 …… 此处隐藏：375字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……