微生物学实验讲义 - 图文(11)

皿放在低倍镜下观察子实体的形态特征，便于根据形态特点进行菌种的鉴定。这是单点接种法所难以做到的。

（1）倒平板：将已灭菌的马铃薯琼脂培养基放在水浴锅中充分加热融化，待冷却至45℃左右（手握不觉得太烫为宜）后，用无菌操作法倒平板，具体操作见图2－5（8）。

（2）贴标签：待平板凝固后，在培养皿底部贴上标签（也可用记号笔写），注明菌名、日期等。

（3）三点接种：用接种针从菌种斜面上分别挑取少量菌种孢子（产黄青霉、黑曲霉等），点接到对应的平板上。一般以三点（∴）的形式接种。操作要点为：

标明三点位置：欲使点接的三点分布均匀，可用记号笔先在平板底部以等边三角形状标上三点。

取接种针：拿接种针，先在火焰上烧红灭菌，并在平板培养基的边缘冷却且蘸湿。 沾取孢子：将灭过菌并蘸湿的接种针伸入菌种管，用针尖沾取少量霉菌孢子。

点接：将接种针上沾着的孢子以垂直的方向轻轻地点接平板培养基表面预先作好标记的部位。注意在点接时切勿刺破培养基。

(4) 培养：将点接好的平板倒置于28℃恒温箱中培养。48小时后开始观察生长情况。

4. 液体菌种接种技术

液体菌种接种技术是一种用移液管、滴管或接种环等将菌液移接到液体三角烧瓶、试管或固体培养基中的一种接种方法。具体操作如下：

（1）移液管的包装灭菌：移液管单支包装法可见图3－1，也可将它们放入铜质或玻璃筒内灭菌。

（2）取移液管：取用单支纸包装的移液管时，可将移液管打有纸结一端的包装纸拧断，露出移液管的末端，取出移液管。

（3）移菌液：用无菌操作吸取所需的菌液，移菌液操作见图4－5（3）所示。 （4）接种：

取待接培养液：左手拿待接种的三角烧瓶培养液（注意勿使瓶口朝天），并用右手的小指和手掌边拔出棉花塞或纱布通气塞，瓶口缓缓旋转过火。

接种：将移液管伸入三角瓶内，慢慢放出菌液至所需的接种量，或将菌液全部吹入三角瓶培养液中，塞上棉塞。在液体菌种中，经常采用倒种方法，即将菌液试管中的菌种倒入待接三角烧瓶培养液中。

（5）移液管灭菌：将用过的移液管投入5％石炭酸缸内灭菌。

（6）扎口：如使用通气塞，则还应将塞子拉好，用棉纱绳以活结形式将通气塞扎牢。 （7）培养：将接种过的三角烧瓶置于恒温箱内或摇床上恒温培养，24小时后观察生长结果。

图4－4 三点接种形成的青霉菌落

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图4－４ 斜面接种后生长的菌苔类型

（五）实验报告内容

1. 检查你的斜面接种情况，绘制斜面生长草图，并说明是属于下列哪一类。 2. 分析你的斜面接种好坏的原因。

3. 检查你的穿刺接种结果，并绘制结果草图。 4. 分析穿刺接种好坏的原因。

5. 检查三点接种生长情况，描述每一菌种的菌落特征。

（六）思考题

1. 接种时，为什么要严格地按照无菌操作程序进行。 2. 斜面接种时，标签要贴在斜面的什么位置，为什么？ 3. 穿刺接种时应注意什么？

4. 三点接种时为什么不要刺破培养基。

二、土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化

（一）目的要求

学习、掌握细菌、放线菌、酵母菌和霉菌稀释分离、划线分离等技术。 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。

学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。

学习平板菌落计数法。

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（二）基本原理

土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多；其次为放线菌和霉菌。一般在较干燥、偏碱性、有机质丰富的土壤中放线菌数量较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在水果表皮、葡萄园、果园土中数量多些。本次实验从土壤中分离细菌、放线菌和霉菌；自面肥或酒曲或果园土分离酵母菌。

为了分离和确保获得某种微生物的单菌落，首先要考虑制备不同稀释度的菌悬液。各类菌稀释度因菌源、采集样品时的季节、气温等条件而异。其次，应考虑各类微生物的不同特性；避免菌源中各类微生物的相互干扰。细菌或放线菌皆喜中性或微碱性环境，但细菌比放线菌生长快，分离放线菌时，一般在制备土壤稀释液时添加l0％的酚或在分离培养基中加相应的抗生素以抑制细菌和霉菌(如加链霉素25～50u/m1以抑制细菌；添加制霉菌素50u /m1或多菌灵30u／m1以抑制霉菌)。酵母菌和霉菌都喜酸性环境，一般酵母菌只能以糖为碳源，不能直接利用淀粉，酵母菌在pH 5时生长极快，而细菌生长适宜的酸碱度为pH7，所以分离酵母菌时，只要选择好适宜的培养基和pH，可降低细菌增殖率。霉菌生长慢，也不干扰酵母菌分离。若分离霉菌，需降低细菌增殖率，一般培养基临用前需添加灭过菌的乳酸或链霉素。为了防止菌丝蔓延干扰菌落计数，分离霉菌时常在培养基中加入化学抑制剂。要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表4－l所示。

（三）实验材料

1. 菌源：选定采土地点后，铲去表土层2～3cm，取3～10cm深层土壤10g，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌相的变化。

表4－1 微生物四大类菌的分离和培养 样品来源 土样 土样 土样 面肥(或土样) 细菌分离平板 分离对象 细菌 放线菌 霉菌 酵母菌 细菌 分离方法 稀释分离 稀释分离 稀释分离 稀释分离 划线分离 稀释度 10－5～10－7 10－3～10－5 10－2～10－4 10－4～10－6 培养基名称 肉膏蛋白胨 高氏合成1号 马铃薯 豆芽汁葡萄糖 肉膏蛋白胨 培养温度℃ 30～37 28 28～30 30～37 28～30 时间／d 1～2 5～7 3～5 1～2 2～3

2. 培养基

肉膏蛋白胨培养基、高氏合成l号培养基、马铃薯培养基、豆芽汁葡萄糖培养基(制平板和斜面)。配方见附录二。

3. 无菌水或无菌生理盐水

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配制生理盐水，分装于250 m1锥形瓶，每瓶装99 ml(或95 m1为分离霉菌用)，每瓶内装10粒玻璃珠。分装试管、每管装9 m1(每人5～7支)。

4. 其它物品

无菌培养皿、无菌移液管、无菌玻璃涂棒(刮刀)、称量纸、药勺、橡皮头、10％酚溶液。

（四）实验步骤 1. 稀释分离法

平板分离菌有倾注法和涂布法两种。本次实验分离细菌、放线菌、霉菌时采用倾注法，酵母菌分离采用涂布法。

1）细菌的分离

制备土壤稀释液：称取土样1g，在火焰旁加入到一个盛有99 m1无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中，振荡10～20 min，使土样中菌体、芽孢或孢子均匀分散，制成10－2稀释度的土壤稀释液。

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按10倍稀释法进行稀释分离，以制备10－7稀释度为例，具体操作过程如下：取9 ml

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