微生物学实验讲义 - 图文(8)

（一）目的要求 了解高压蒸汽灭菌原理。

学习并掌握高压蒸汽灭菌的操作。

（二）基本原理

高压蒸汽灭菌是微生物学实验、发酵工业生产、以及外科手术器械等方面最常用的一种灭菌方法。一般培养基、玻璃器皿、无菌水、无菌缓冲液、金属用具、接种室的实验服及传染性标本等都可采用此法灭菌。

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安全阀 温度计 压力表 放气阀 蒸汽入口 安全阀 排气口 压力表 安全阀 水位显示 排气口 排水口 图3－7 高压蒸汽灭菌锅结构

高压蒸汽灭菌器是一个能耐高压、同时可以密闭的金属锅，有立式、卧式、手提式三种（图3－7）。热源可以用蒸汽、煤气或电源。灭菌器上装有表示锅内温度和压力的温度计、压力表。灭菌锅还有排气口、安全活塞，如果压力超过一定限度，活塞的阀门便自动打开，放出过多的蒸汽。

高压蒸汽灭菌是把待灭菌物品放在一个密闭的高压蒸汽灭菌锅中，当锅内压力为0.1MPa时，温度可达到121℃，一般维持20 min即可杀死一切微生物的营养体及其孢子。高压蒸汽灭菌是依据水的沸点随水蒸汽压的增加而上升，加压是为了提高水蒸汽的温度。蒸汽压力与蒸汽温度关系及常用灭菌时间见表3－1

表3－1 高压蒸汽灭菌时常用的灭菌压力、温度与时间 蒸 汽 压 力*

Pa 56 70 100

kg/cm 0.56 0.70 1.00

2

蒸汽温度

b/in 8.00 10.00 15.00

2

灭菌时间(min)

(℃) 112.6 115.2 121.0

30 20 20

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*1 kg/cm2(1千克/厘米2)≈105 Pa，1b/in2（1磅/寸2）≈6894.76 Pa，将几种单位列于同一表内以便于换算。

表3－2 空气排除程度与温度关系

压力表读数/Pa 35 70 105 140 175 210

高压蒸汽灭菌技术关键是在压力上升之前需将锅内冷空气排尽。若锅内未排除的冷空气滞留在锅中，压力表虽指121℃，但锅内温度实际上只有100℃（空气排除程度与温度关系见表3－2），结果造成灭菌不彻底。

待灭菌物品中的微生物种类、数量与灭菌效果直接相关。一般在小试管、锥形瓶中小容量的培养基，用121℃灭菌20min，大容量的固体培养基传热量慢，灭菌时间适当延长（灭菌时间是指达到所要求的温度开始计算）。天然培养基含菌和芽孢较多，较合成培养基灭菌时间略长。

灭菌时的过高温度常对培养基造成不良影响。如：

（1）出现浑浊、沉淀（天然培养基成分加热沉淀出大分子多肽聚合物；培养基中Ca、Mg、Fe、Zn、Cu、Sb等阳性离子与培养基中可溶性磷酸盐共热沉淀。）

（2）营养成分破坏或改变（酸度较高时淀粉、蔗糖、乳糖或琼脂灭菌过程易水解；pH7.5、121℃灭菌20 min，葡萄糖破坏20%，麦芽糖破坏50%，若培养基中磷酸盐共存，葡萄糖转变成酮糖类物质，培养液由淡黄色变为红褐色，破坏更为严重。

（3）pH7.2时培养基中的葡萄糖、蛋白胨、磷酸盐在121℃灭菌15 min以上可产生对微生物生长的某种抑制物。

(4) 高压蒸汽灭菌后培养基pH下降0.2～0.3。

(5) 高压蒸汽灭菌过程会增加冷凝水，降低培养基成分浓度。

对于前三种不良影响，可采用低压灭菌(如在112℃、30 min灭菌葡萄糖溶液)，或将培养基几种成分分别灭菌，临用前无菌混合（如磷酸盐与Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+等阳性离子溶液）的方法，特殊情况时可采用间歇灭菌、过滤除菌（如维生素溶液）。工业发酵生产中常采用连续加压灭菌法(135～140℃、5～15s)和连续蒸煮法。

灭菌前配培养基时适当调整。

（三）实验材料 手提式高压蒸汽灭菌锅。

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未排除空气

排除1/3空气

灭菌器内温度/℃

排除1/2空气

排除2/3空气

完全排除空气

72 90 100 109 115 121

90 100 109 115 121 126

94 105 112 118 124 128

100 109 115 121 126 130

109 115 121 126 130 135