微生物学实验讲义 - 图文(13)

培养：冷凝后，将平板倒置于28℃恒温箱中，培养3～5d后观察结果。 4）酵母菌的分离

制备菌悬液：称取面肥1g，加入到一个盛有99 ml无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中，面肥发黏，用接种铲在锥形瓶内壁磨碎后移入无菌水或生理盐水内，振荡20 min，即成10释液。

涂布法分离：依前法向无菌培养皿中倾倒已融化并冷却至45～50℃的豆芽汁葡萄糖培养基，待平板冷凝后，用无菌移液管分别吸取上述10、10、10

－6

－5

－4

－2

的面肥稀释液。若选用果园土样，也依前法称取1g土样，制成10

－2

土壤稀

三个稀释度菌悬液0.1ml，

依次滴加于相应编号已制备好的豆芽汁葡萄糖培养基平板上，右手持无菌玻璃涂棒，左手拿

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培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，在火焰旁右手持玻璃涂棒于培养皿平板表面将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散，切忌用力过猛将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破（图4－7）。

培养：待平板完全冷凝后，将平板倒置于30℃恒温箱中，培养2～3d后观察结果。

图4－7 涂布操作过程示意图

2. 划线分离法

菌种被其它杂菌污染时或混合菌悬液常用划线法进行纯种分离。此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散成由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。平板制作方法如前所述。但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍干后方可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20 ml培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。划线分离主要有连续划线法和分区划线法两种。连续划线法是从平板边缘一点开始，连续作波浪式划线直到平板的另一端为止，当中不需灼烧接种针上的菌(图4－8A)；另一种是将平板分四区，故又称四分区划线法。划线时每次将平板转动60～70°划线(见图4－8B)，每换一次角度，应将接种针上的菌烧死后，再通过上次划线处划线。

A.连续划线法 B.分区划线法 图4－8 划线分离方式

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1）连续划线法

以无菌操作用接种环直接取平板上待分离纯化的菌落。将菌种点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余菌体。将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷凉，然后从接种有菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面成30～40°。以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线，接种环不要嵌入培养基内划破培养基，线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重迭(图4－8A，4－9)。划线完毕，关上皿盖。灼烧接种环，待冷凉后放置接种架上。培养皿倒置于适温的恒温箱内培养(以免培养过程皿盖冷凝水滴下，冲散已分离的菌落)。培养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯种后再接种斜面。

图4－9 划线分离接种示意图

2）分区划线法(四分区划线法，图4－8B)

取菌、接种、培养方法与“连续划线法”相似。分区划线法划线分离时平板分4个区，故又称四分区划线法。其中第4区是单菌落的主要分布区，故其划线面积应最大。为防止第4区内划线与1、2、3区线条相接触，应使4区线条与1区线条相平行，这样区与区间线条夹角最好保持120°左右。先将接种环蘸取少量菌在平板1区划3～5条平行线，取出接种环，左手关上皿盖，将平板转动60～70°，右手把接种环上多余菌体烧死，将烧红的接种环在平板边缘冷却，再按以上方法以1区划线的菌体为菌源，由1区向2区作第2次平行划线。第2次划线完毕，同时再把平皿转动约60～70°同样依次在3、4区划线。划线完毕，灼烧接种环，关上皿盖，同上法培养，在划线区观察单菌落。

本次实验在分离细菌的平板上选取单菌落，于肉膏蛋白胨平板上再次划线分离，使菌进一步纯化。划线接种后的平板，倒置于30℃恒温箱中培养24h后观察结果。

3. 微生物菌落计数(平板菌落计数法)

含菌样品的微生物经稀释分离培养后，每一个活菌细胞可以在平板上繁殖形成一个肉眼可见的菌落。故可根据平板上菌落的数目，推算出每克含菌样品中所含的活菌总数。

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