分子光谱分析03解析 - 图文(8)

5.4 荧光测定物理条件的选择

荧光测定可变因素比较多，只有选好条件才能获得满意的激发和发射光谱。由于样品和仪器各不相同，因此测定条件不能固定不变。应当寻找仪器最佳条件。

灯电流 光源灯电流不能超过测定范围，但为了提高测定灵敏度，可以调节灯电流到最大允许值。

波长扫描范围： 对已知光谱特性的样品，不需进行广泛扫描。在测试一个未知光谱特性的样品的激发和发射光谱时 扫描样品时范围应该宽一些。如扫描发射光谱时，在短波方向应该多扫一些，以观测瑞利散射和喇曼散射的影响。 狭缝宽度 选好激发和发射单色器狭缝单色器宽度，是获得一个好图谱的关键。对定性分析来说，希望窄一些，因为狭缝窄谱带纯，能得到精细的光谱。对于定量测定狭缝小，光强弱，会影响测定的灵敏度和准确性，因而狭缝宽度不能过窄。 样品池：进行精确分析时应该使用正方形池。微量池的优点是样品用量少和克服内滤光效应。缺点是狭缝宽度较大时池壁的散射和反射会进入发射单色器，使空白荧光增加。

光电倍增管的电压： 为了提高测定灵敏度，有时可以把光电倍增管的电压提高到最大允许值。但此时光电倍增管容易疲劳暗电流和噪音会因此增加。另外光电倍增管的灵敏度和波长响应与温度密切相关，因此温度较高时要注意散热。

灵敏度：一般说来，灵敏度越高，所得的荧光强度越大，但仪器噪音和溶液的拉曼光也就越大。有时对于一个稀溶液，为了得到大的荧光强度以准确定量采用大缝宽和高灵敏度，但却会导致散射峰干扰，甚至掩盖了弱小荧光峰。 扫描速度 太快，响应不同步，容易漏掉小峰。

6 荧光分析新技术简单介绍

6.1 激光荧光分析

激光荧光分析采用发射光强度大，波长更纯的激光作光源，该光源大大提高了荧光分析方法的灵敏度和选择性。利用激光光源的相干性可以产生非常理想的辐射，以激光为光源可以使仪器仅仅使用一个单色器，加上利用可调谐激光器的

可调功能获取激发光谱发射光谱。目前，激光诱导荧光分析法已经成为分析超低浓度物质的灵敏而有效的方法。在分析单细胞核内元素时，最小可以测到10-16-10-14g

6.2 时间分辨荧光分析

由于不同分子的荧光寿命不同，可以在激发和检测之间延缓一段时间，使具有不同荧光寿命的物质达到分别检测的目的。这就是时间分辨荧光分析。进行这种测量的具体做法是采用带有时间延迟设备的脉冲光源和和带有门控时间电路的检测器件，从而可对光谱重叠但寿命有差异的组分进行进行分辨和和分别测定。或者是固定发射波长，得到荧光强度随时间的衰变曲线和给定时间出的荧光发射光谱，可用于荧光寿命的测量，溶剂弛豫时间的测量。

时间分辨荧光测定常用的光源是激光器，例如氩离子离子激光器可提供重复频率为76MHz，脉冲宽度为100ps的351 nm激光光束。可调谐染料激光器还可以选择所需要的激发波长。在采用激光光源的时间分辨荧光计中由光束分裂器来的一部分激光，作为外触发信号，利用电子延迟电路选择控制一定延迟时间使盒式积分器门控开门，将样品发射并经光电倍增管放大后的信号输至盒式积分器获取信号。

利用时间分辨荧光分析，如果选择了合适的延缓时间，可以把待测组分的荧光和其他组分或杂质的荧光以及仪器的噪音分开而不受干扰。该法在测定混合物中某一组分时的选择性比用化学法处理样品更好，而且省去前处理的麻烦。

6.3 同步荧光光谱分析

同步荧光分析根据激发单色器和发射单色器在扫描过程中彼此间保持的关系，同步扫描荧光技术可分为固定波长差， 固定能量差，和可变角同步扫描三类。固定波长差方法将激发和发射单色器波长维持一定的差值??，得到同步荧光光谱。这时如果 ?? 相当于或者大于斯托克额斯位移，能够获得尖而窄的荧光峰。荧光物质分子浓度与同步荧光光谱的峰高成线性响应关系。

同步荧光光谱的荧光强度与激发光信号， 荧光发射信号的关系为 ： 当物质的浓度一定时，同步荧光信号强度与所用的激发光谱信号和荧光发射光谱信号的乘积成正比。

Fsp (?em , ?ex) =K C FemFex . K 为常数，C为待测物的浓度。所以此法灵敏度较高。

固定波长差同步扫描中，??的选择直接影响到所得到同步荧光光谱的形状，带宽，和信号强度，从而提供一种提高选择性的途径。

例如，铬氨酸和色氨酸的荧光激发光谱很相似，发射光谱又严重重叠，但???15 nm的同步光谱只显示铬氨酸的光谱特征，???15 nm的同步光谱只呈现色氨酸的光谱特征，从而可以实现分别测定。固定能量差同步扫描和可变角同步扫描技术可以进一步提高选择性和最大限度地减少瑞利散射和拉曼散射的干扰。同步扫描技术具有使光谱简化，使谱带变窄，提高分辨率减少光谱重叠提高选择性，减少散射光影响等优点。

6.4三维光谱扫描

三维光谱可以同时获得激发波长和发射波长同时变化的荧光强度信息。 三维光谱有两种表现形式：等高线图和伪三维投影图。能够获得完整的光谱信息，是一种很有价值的光谱指纹技术 ，在临床中已经用语癌细胞的辅助诊断和不同细菌的表征和鉴别。另外作为一种快速检测技术，对化学反应的多组分动力学有独特的优点，目前采用三维光谱技术进行多组分混合物的定性定量是分析化学热点之一。 …… 此处隐藏：323字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……