分子光谱分析03解析 - 图文(5)

某些猝灭剂分子与荧光物质分子相互作用发生了电子转移反应，引起荧光猝灭。如甲基蓝溶液的荧光被Fe2+ 离子猝灭就是这种情况。其他的I- 、Br—、 CNS-—

、S2O32- 等易给出电子的阴离子，对奎宁，罗丹明及荧光素钠的物质的荧光也

会发生猝灭作用。 荧光物质的自猝灭：

在浓度较高的荧光物质溶液中往往会发生自猝灭现象。其原因是单线激发态的分子在发生荧光之前和未激发的荧光分子碰撞引起自熄灭，如蒽和苯。有些荧光物质分子在溶液浓度高时会形成二聚体或多聚体，使其吸收光谱发生变化，也引起溶液荧光强度的降低或消失。解决方法： 稀释样品； 标准加入法。 Stop

2.3.5散射光的干扰

当一束平行光照射在液体样品上，大部分光线透过溶液，小部分由于光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射，这种光称为散射光。

瑞利散射：当光子和物质分子发生弹性碰撞时，不发生能量交换，仅仅是光子的运动方向发生改变，这种散射叫瑞利散射光。其波长与入射光波长相同。 拉曼散射：光子和物质分子发生非弹性碰撞时，在光子运动方向发生改变的同时，光子与物质分子发生能量交换。光子把部分能量转给物质分子后，在一定条件下，分子所获得的能量使得围绕其中某一健分布的电子云产生瞬时弹性变形，这时辐射能量暂时保留在变形的极化分子的一个虚态上。这个虚态并不存在常规电子能级图中，电子在那里只能保持10-15-10-14秒时间，随后回到其电子能态基态的不同振动能级上，发射出比入射波长长或稍短的光，称为拉曼光。

散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射光波长更长的拉曼光，因为一般同时产生的多条拉曼辐射线，可以复合成一个覆盖一定波长范围的较宽的带，如果这种辐射带正好和荧光辐射的波长相近，就会对荧光测定产生干扰。因此在荧光测定中必须采取措施避免这种干扰。

选择适当的激发波长可以消除拉曼光的干扰。以硫酸奎宁为例。从图4可见，无论选320nm或者350nm 为激发光,荧光峰总是在448 nm。分别在320nm和350nm激发光下测定空白溶剂的发射光谱， （这种情况下并没有发生荧光发

射，得到的是拉曼散射光）。从图b 可见， 当激发波长为320 nm 时瑞利光波长是320 nm ，拉曼光波长是360 nm ，拉曼光对荧光无影响；。当激发波长为350 nm 时瑞利光波长是350 nm ，拉曼光波长是 400 nm ，拉曼光对荧光有干扰，因而影响测定结果。

图4 硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱

水， 乙醇，环己烷，四氯化碳，氯仿这5种溶剂是最常用的溶剂，他们自身都能发射拉曼散射光，从而可能干扰荧光测定。表2 列出了不同波长激发光照射下的拉曼辐射波长，可供选择激发波长或溶剂时参考。

表2 不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长

溶剂 激发波长

248 313 365 405 436 ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 水 271 350 416 469 511 乙醇 267 344 409 459 500 环己烷 267 344 408 458 499 四氯化碳 -- 320 375 418 450 氯仿 -- 346 410 461 502

2.3.6 内滤光作用和自吸收现象

溶液中如果存在着能吸收激发或荧光物质所发射的光能的物质，就会使荧光减弱，这种现象称为“内滤光作用“。例如在1ng/ml的色氨酸溶液中如果有重铬酸钾存在，由于在色氨酸的激发和发射峰附近正好是重铬酸钾的两个吸收峰，吸收了色氨酸的激发能和色氨酸发射的荧光，使测得的色氨酸荧光大大降低。

内滤光作用的另一种情况是荧光物质的荧光发射光谱短波长一端与与该物质的吸收光谱的长波长的一端有重叠。

在溶液浓度较大时一部分荧光发射被自身吸收，产生所谓自吸收现象，降低了溶液的荧光强度。

3定量分析方法

3.1强度与浓度的关系

由于荧光物质是在吸收光能被激发之后才发射荧光的，因此溶液的荧光强度与该溶液中荧光物质吸收光能的程度以及荧光效率有关。溶液中荧光物质被入射光（I0）激发后可以在溶液的各个方向观察荧光强度（F）。.但由于激发光有部分透过（I），这部分透过的入射光会干扰对荧光的测定，因此应该在与激发光源垂直的方向进行测定。设溶液中荧光物质的浓度为C，液层厚度为L，荧光强度F正比于被荧光物质吸收的光强度，即： F ? (I0— It) ，F ? Ia

F= K’ Ia, 公式中K’为常数, 其数值取决于荧光效率。

根据Lambert –Beer定律

Ia= I0 —It=I0 (1—10-ECL) = I0 (1—e -2.3ECL)

e -2.3ECL =1+ (-2.3ECL)1/1! +(-2.3ECL)2/2!+(-2.3ECL)3/3! +(-2.3ECL)4/4!+…….. 若浓度很小，ECL值也很小，ECL<0.05时 ，式中第二项以后的各项可以省略，

于是

e -2.3ECL =1— 2.3ECL F = K’ Ia = K’ I0 (1—e -2.3ECL)

= 2.3 K’ I0 ECL

当入射光光强度和液层厚度一定，上式简写为

F= KC

在低浓度时溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度呈线性关系。荧光分析方法定量的依据是荧光强度与荧光物质的浓度的线性关系，而荧光强度的灵敏度取决于检测器的灵敏度，即只要改进光电倍增管和放大系统使极弱的荧光也能被检测到，可以测定很稀的溶液的浓度，因此荧光分析法的灵敏度很高。

3.2定量分析方法

标准曲线法：浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制工作曲线，在同样实验条件下测定样品溶液。

在绘制工作曲线时常采用系列中某一个标准溶液作为基准，将空白溶液的荧光强度读数调到0% 将该标准溶液的荧光强度调到100%或50%。在实际工作中当仪器调零之后先测定空白溶液的荧光强度，然后再测定标准溶液的荧光强度, 从后者减去前者即可, 然后绘制标准曲线。

为了使在不同时间所绘制的标准曲线能够一致，在每次绘制曲线时均采用同一个标准溶液对仪器进行校正。如果试样在紫外光下不稳定，可以改用另一种稳定的标准溶液作为基准，只要其荧光峰和试样溶液的荧光峰相近似，例如测定维生素B1时，可采用硫酸奎宁作为基准。

在使用工曲线法定量时须注意

荧光分析所用的试剂标准品一定要纯，样品池要清洁。

被分析的样品不能用激发光长时间照射，以免荧光物质发生分解。 标准溶液样品溶液应该在同一条件进行测定荧光强度。

荧光猝灭法； 在一般荧光分析方法中一些荧光猝灭剂应该事先分离。但也可以利用猝灭现象用于荧光分析。若某一物质本身不会发射荧光，也不与其他物质形成荧光物质，但他们会使另一种发射荧光的物质荧光强度下降，下降程度与该物质的浓度成比例，以次建立的荧光分析方法叫荧光猝灭法。例如氟离子会使铝-八羟基喹啉洛和物的荧光强度下降，在适当条件下荧光强度与氟离子的浓度成反比例，可用于痕量氟的测定。 动力学荧光分析法

化学反应时其中反应物或产物中有荧光物质，随着反应的进行，因为浓度变化引起荧光强度随时间的变化，可以求出物质的含量，以此建立动力学荧光 …… 此处隐藏：1838字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……