分子光谱分析03解析 - 图文(7)

Fs —F0 =K Cs Fx — F0 =K Cx

对于同一荧光物质，常数K相同

（Fs —F0 ）/（Fx — F0）= Cs /Cx Cx =（Fx — F0）/（Fs —F0 ）* Cx

多分混合物分析.:

如果不同组分的荧光光谱相互重叠可以考虑利用荧光强度的加合性质在适宜的波长处测定混合物的荧光强度，再根据被测各个组分的各自在适当的荧光波长处的荧光强度 列联立方程求出各自含量。 导数荧光光谱分析法

也叫微分荧光光谱分析法，用物质荧光强度对对其荧光波长的导数值与其对应波长作图可得导数荧光光谱。

dI/d?— ? 曲线 一阶导数荧光光谱

随着导数阶数的增加，荧光峰的尖锐程度增大，带宽减少，分辨率提高。将靠的很近的，重叠的荧光峰分别开来，还可以清楚地辨认陡坡上的弱小峰肩蜂，宽峰可以准确给出峰位。提供更多的结构信息，用于定性。用荧光导数值与样品浓度值呈线性关系可以用导数荧光光谱分析法定量。

4荧光分析方法的特点

灵敏度高 与紫外可见分光光度法法比较,荧光是从与入射光成直角方向检测，即在黑背景下（有很小的噪声背景）检测荧光发射信号。所以可以用增强入射光强度或增大荧光放大倍数来提高灵敏度；在吸收光度法中不但要测定透过试

样的光强度I，还要测量入射光强度I0. 当试样浓度很低，吸收微弱，I 和I0非常接近，检测器很难区分两个较大信号之间的微小差别。此外在分光光度法中如果增加入射光强度I0，I也按比例变化，若提高检测器信号的放大倍数，其放大作用I0和I是同样的。因此荧光分析的灵敏度要比分光光度法光高2-4个数量级。测定下限在0.1-0.001ng/ml之间。紫外可见分光光度法的灵敏度为10-7g/ml 而荧光光度法测定的灵敏度在 10-10 –10-12g/ml之间。

选择性好 既可根据特征发射又可以根据特征吸收来鉴定物质。如果某几个物质的发射光谱相似，可以从其激发光谱的差异将其区分开来。而如果他们的吸收光谱相同，则使用发射光谱将其区分。

所需样品量少，方法简便

提供较多的物理参数 可以提供激发光谱，发射光谱，荧光强度，荧光效率，荧光寿命，荧光偏振等参数，可以从不同角度反映荧光物质分子的各种特性，并通过这些物理参数得到被研究的物质的更多的信息。

缺点 应用范围不够广泛，本身能够发射荧光的物质较少，加入某种试剂经衍生化后才能测定的物质也不是很多。

由于荧光分析的灵敏度高，测定时对环境因素敏感，干扰因素较多。如温度 溶剂，酸度，散射光等。

5 荧光分析仪

5．1 仪器组成

用于荧光测定的仪器由以下四个部件组成： 激发光源；样品池，单色器，检测器（图 5）。由光源发出的光经过第一单色器得到所需要的激发光波长，激发光通过样品池，荧光物质被激发后发射荧光。为了消除入射光和散射光的影响通常在与激发光垂直的方向上测定荧光。为了消除可能存在的其他光的干扰，如激发光产生的反射光，瑞利散射光和拉曼散射以及溶液中杂质产生的荧光，以便获得所需要的荧光，在样品池和检测器之间设置了第二个单色器，荧光作用于检测器上，记录相应的电信号。经过放大被记录下来。

图5 荧光光度计基本组成框图

图6 F-4500荧光光度计光路图

激发光源 在紫外可见光范围， 常用的光源是高压氙灯和高压汞灯。氙灯内装有氙气，氙灯发射的光谱强度大，而且是连续光谱分布在200-700nm 范围内，并且在300-400 波长之间的强度几乎相等。目前大多数荧光计使用它作光源。

高压氙灯是一种气体放电灯，外套为石英，内充氙气，室温下压力0.5Mpa (5 atm) ，工作时压力为2Mpa (20 atm)。氙灯内充气总是处于高压状态先灯寿命约为2000小时，在安装或更换时要戴上防护镜或者严格按照操作规程进行以便防

止以外发生。由于氙灯的启动电压在 20-40 KV，，不仅人体要注意安全，在仪器配有计算机是，应先点着氙灯带稳定后再开计算机。

样品池 液体样品池通常用石英材料制成，形状以方型或者长方形为好，因为这种形状散射光干扰较少。固体样品用可用样品架。

单色器 包括色散元件和狭缝。较高级的单色器采用光栅。其优点是在所有波长都能够色散而且色散均匀，有相同的分辨率。入射光的80%能量在一级光谱中。第一单色器用于选择所需要的激发波长第二单色器用于分离出荧光发射波长。

狭缝关系到单色器分辨率的优劣， 用于控制谱带宽度和光强度。一般说来，狭缝越窄单色性越好。但光强随之减小而降低灵敏度。在实际使用时应该两者兼顾。

检测器要求有较高的灵敏度，一般应用光电倍增管作检测器。

5．2仪器的校正

灵敏度校正

荧光光度计的灵敏度可以用被检测出的最低信号来表示，通常以硫酸奎宁的检出限或者以纯水的的拉曼峰的信噪比（S/N）表示。

荧光光度计的灵敏度与光源强度，单色器（包括透镜，反射镜）的性能，放大系统的特征，和光电倍增管的灵敏度有关；

与所选用的波长，狭缝宽度有关。

与被测空白溶剂的拉曼散射，激发光，杂质荧光有关。

由于影响因素多，同一型号的仪器，甚至同一台仪器在不同时间操作，所测得的结果也不尽相同。因而在每次测定时，在选定波长和狭缝宽度的条件下，先用一种荧光性质稳定，浓度固定的标准液进行校正，将每次所测得的荧光强度调整到相同数值（50%或100%）。如果被测定的物质所产生的荧光很稳定，自身就可以作为标准溶液。紫外可见范围内最常用的是1?g/ml（0.05mol/l 硫酸中）硫酸奎宁标准溶液。因为其产生的荧光十分稳定。

波长校正

荧光分光光度计的波长出厂前都经过了校正，若仪器的光学系统和检测器有所变动，或较长时间使用后，或在重要部件更换后，有必要用汞灯的标准谱线对单色器刻度重新校正，这一点在要求较高的测定工作中尤为重要。

激发光谱和荧光光谱的校正

荧光分光光度计所测得的激发光谱或荧光光谱往往随着仪器不同而不同。 原因：

单色器波长的准确度，拉曼散射光的影响，以及狭缝宽度等。

其最主要的原因有光源的强度随波长变化 ，检测器对不同波长光的接受敏感程度不同，检测器的响应与光强不成线性。

由于以上原因，在用单光束仪器测定激发和发射光谱时，因为不能用参比溶液进行相对校正，误差较大。尤其是当波长处于检测器灵敏度曲线的陡坡时得到的“表观光谱”中的值之间的相对关系不能反映真实情况，产生了显著误差。因此可先用仪器上附有的校正装置将每一个波长的光源强度调整到一致，然后根据表观光谱每一个波长的强度除以检测器对每一个波长的感应强度进行校正以消除误差。

目前生产的光度计大都是双光束光路，可以用参比光束抵消误差。

5.3 荧光分析仪器的维护

要正确提供主机及附件所需的供电电压和频率，不可接错电源。

拿灯时不要碰窗口，如果不小心碰触，及时用无水乙醇擦净，灯源不稳定或强度太弱而影响测定时，应换灯；

不要用肉眼直视灯源，以免损伤眼睛。

单色器不得轻易拆卸，保持内部干燥，以防色散元件和反射镜受潮。 放样品池时要固定一个方向，免得液池各透光面被池架的弹簧片擦坏，增加散射。液池要洗净，不得留有痕迹影响测定。

新的液池常常挂水，可用3mol/l 盐酸和50%乙醇等量混合液浸泡。 保持光电倍增管室干燥，保证绝缘良好，光电倍增管通电后避免不必要 …… 此处隐藏：1318字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……