western blot原理，操作 - 图文(5)

SuperSignal? West SuperSignal? West SuperSignal? West Pico化学发光底物 Femto超灵敏型底物 Femto增强型底物 与ECL? 系统相比减延长的信号持续时间

适用于HRP检测的最灵

主要优点 半的价格、双倍的信使这种底物用于今天

敏的化学发光底物

号 的成像设备最为理想

检测下限 10-12g 10-15g 10-14g 信号持续

6-8小时 8小时 24小时

时间 首选检测

X胶片 成像设备或X胶片 成像设备或X胶片

方法 建议一抗

1:1000-1:5000 1:5,000-1:100,000 1:1000-1:50,000

稀释度 建议二抗

1:20,000-1:100,000 1:100,000-1:500,000 1:50,000-1:250,000

稀释度 产品保存

室温1年 4℃1年或室温6个月 室温1年

期

建议印迹

硝化纤维

膜

硝化纤维或PVDF 硝化纤维或PVDF

X-ray 胶片：传统上使用手工曝光的方法，可控制X-ray 胶片在曝光和在定影剂的时间调节。而全自动X-ray 胶片曝光器也广泛使用并操作简便。

注意不能过度曝光，特别不适于检测相对蛋白量，过度曝光导致全暗的背景没有反差和/或产生大量的非特异性条带。

数字图像显影：新一代的胶片显色方法是使用数码相机在暗室中拍摄膜上的化学发光，将其转成数字信号，再通过仪器自带的软件进行分析。 有些新一代商品化的数字成像仪器已不再检测HRP连接的抗体（如：ECL chemiluminescence），如STORM分析仪只检测荧光标记的抗体。 D 常见问题分析与解决方案 问题 可能原因 封闭不充分 一抗浓度过高 抗体孵育温度过高 二抗非特异性结合 背景高 或与封闭剂交叉反应 一抗或二抗与封闭剂 有交叉反应 洗膜不充分 膜不合适 膜干燥 一抗、二抗等不匹配 没有阳性条带 一抗或/和二抗浓度低 封闭剂与一抗或二抗有交或很弱 叉反应 一抗不识别目的物种的靶蛋白 样本中无靶蛋白或靶蛋白验证或解决办法 延长封闭时间， 更换合适的封闭剂（脱脂奶粉，BSA，血清等）增加一抗稀释倍数, 4℃孵育 设置二抗对照(不加一抗),降低二抗浓度 在孵育和洗涤液中加入Tween-20 以减少交叉反应. 增加洗涤次数 NC膜比PVDF膜背景低 保证充分的反应液，避免出现干膜现象 订购试剂时认真选取一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间相匹配的抗体及底物。可通过设置内参可以验证二级检测系统的有效性。 增加抗体浓度，延长孵育时间 封闭时使用温和的去污剂，如TWEEN20，或更换封闭剂（常用的脱脂奶、BSA、血清或明胶 检查说明书，或做ClustalW比对，设阳性对照设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没含量过低（抗原无效） 转膜不充分,或洗膜过度 过度封闭 一抗失效 二抗受叠氮钠抑制 酶和底物失效 曝光时间过短 细胞传代次数过多，使其蛋使用原始或传代少的细胞株，或平行实验 白表达模式的分化 体内表达的蛋白样本具有多种修饰形式：乙酰化、磷查文献，使用去修饰的试剂使蛋白恢复其正确的酸化、甲基化、烷基化、糖大小 基化等 使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂 多非特异性条蛋白样本降解 带 新蛋白或同族蛋白的分享查其它文献报导，或BLAST搜寻，使用说明书报同种表位的不同剪接方式 导的细胞株或组织 或条带位置不一抗浓度过高 降低抗体浓度，可以减少非特异性条带 对 二抗浓度过高 降低抗体浓度，增加二抗对照 产生非特异性结合 抗体未纯化 蛋白存在二聚体或多聚体 以增强蛋白质解聚变性 转膜时有气泡或抗体分布背景有白色/黑不均 色斑点 抗体与封闭剂结合 暗片现白条带 一抗或二抗加入过多 目的条带过低/SDS-PAGE胶浓度选择不合过高 适 迁移过快 “微笑”条带 电泳温度过高 尽量去除气泡，抗体孵育时保持摇动 有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。后者可增加标本上样量至少每孔20-30ug蛋白,样本制备时使用蛋白酶抑制剂,或分级提取目的蛋白。 使用丽春红S检测转膜效果,PVDF膜需浸透,需正确的转膜操作,勿过度洗膜 使用含0.5%脱脂奶或无脱脂奶的抗体稀释液,或更换封闭剂,减少封闭时间 使用有效期内抗体,分装保存,避免反复冻融取用, 工作液现配现用 所用溶液和容器中避免含有叠氮钠(HRP的抑制剂) 直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物,使用新鲜的底物. 延长曝光时间 选择特异性更强，只针对重链的二抗 使用单克隆或亲和纯化的抗体，减少非特异条带SDS-PAGE电泳上样前，煮沸10 min， 过滤封闭剂 稀释抗体的浓度 调整胶浓度，分子量大的蛋白用低浓度胶，分子量小的蛋白用高浓度胶 降低电泳速度，低温电泳（冷室） 膜没有完全均匀湿透 靶蛋白分子量小于10,000 靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液pH值 转膜不充分 使用100% methanol浸透膜 选择小孔径的膜，缩短转移时间 可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液（pH 10.5或使用低pH值缓冲液如乙酸缓冲液 过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑甲醇浓度过高 制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替 对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时转移时间不够Thick gel 间

O

ptimization of secondary antibody dilution for immunodetection of ERK 1 with Immobilon Western

Chemilumin-escent HRP Substrate. Two-fold dilutions of rat liver lysate samples were applied to each gel.

Electroblotted proteins were probed with rabbit anti-ERK 1 antibody (1:1,000 dilution) and HRPconjugated goat anti-rabbit IgG (1:5,000, 1:20,000 and 1:100,000dilutions, left to right).

附录1 WB实验试剂配方

1 Nonidet-P40 (NP40) buffer 150 mM sodium chloride 1.0% NP-40 (或Triton X-100 )