western blot原理，操作 - 图文(2)

4 4℃摇动30 min

5 4℃离心12,000 rpm，20 min（根椐细胞种类不同调整离心力） 6 轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀.

A-1-2 组织裂解

1 用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解，

2 将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-80°C，

3 每约5 mg加入约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer，冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，（最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml, 理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml). 4 4℃离心12,000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀,

A-2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂

推荐购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或COOKTAIL，或按下表配制：

备注：其中Sodium orthovanadate 配制活化方法如下： 所有步聚均需在通风橱中进行： 1. 用双蒸水配制100 mM 正矾酸钠溶液. 2. 用盐酸HCl 调至pH 9.0

3. 煮沸至溶液无色,尽量减少水分挥发. 4. 冷却至室温 5. 再调pH 至 9.0 6. 再煮沸至无色

7. 重复上述过程,直至溶液煮沸冷却后达pH 9.0 8. 用水定容至原体积

9. 分装保存于- 20°C. 溶液变黄则弃之不用.

A-3 蛋白定量

Bradford 法 Lowry 法或BCA 法 （均有商品化试剂盒可选择，操作简单、需分光光度计或酶标仪），小牛血清白蛋白 (BSA) 作为标准曲线。如果

裂解液中有NP40或其它表面活性剂，则推荐使用BCA 法。三种方法或产品比较列表如下：

方法 Lowry法 原理 灵敏性 蛋白质在碱性溶液中较高约5μg/ml 肽键与Cu2+螯合，形成Folin－酚蛋白质一铜复合物，对可达试剂法 还原酚磷钼酸产生蓝1-1500μg/ml 色化合物，蓝色深浅与蛋白质浓度呈线性 关系 干扰因素 应用 适用于脂类含量耗费时间长较高的样品测定，40～60分也能耐受相当浓钟；操作要度的去垢剂如严格计时；SDS。 颜色深浅随不同蛋白质受硫酸铵；Tris变化; 标准缓冲液；甘氨酸；曲线不是严各种硫醇干扰 格的直线形式，且专一性差 Bradford法 考马斯亮蓝G-250与高约1～5μg/ml, 易受强碱性缓冲快速5～15蛋白质结合呈蓝色，液，TritonX-100，分钟，颜色微孔法测定范围为SDS等去污剂的稳定；深浅在波长595nm吸收峰，在一定的范围内与蛋1-25μg/ml 影响 随不同蛋白白质的含量呈线性关质变化; 标试管法测定范围为系 准曲线有轻100-1500μg/ml 微的非线性 BCA法 BCA法基于双缩脲原很高0.5-20μg/ml 不易受一般浓度较快40分钟理，碱性条件下蛋白去污剂的干扰 内，较好的2+ 试管法可测范围 质将Cu还原成 方法；抗干20–2,000 可受螯合剂；略高扰能力强 Cu1+ ，BCA浓度的还原剂的（Bicinchoninic μg/ml 影响 酸）螯合Cu1+ 作为显色剂，产生兰紫色微孔法为 0.5～并在562 nm有吸收峰10μg/ml 单价Cu1+与蛋白呈剂量相关性， BCA测定方法如下: A． 酶标板操作

1. 标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂 孔号 蛋白标准溶液（μL） 去离子水（μL） 对应蛋白含量（μg） 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 4 8 12 16 20 20 19 18 16 12 8 4 0 0 0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 2. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀； 3. 各孔加入200μL BCA工作液；

4. 把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30分钟，然后在562nm下比色测定。以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；

5. 稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为20μL，加入BCA工作液200μL，充分混匀，37℃放置30分钟后，以标准曲线0号管做参比，在562nm波长下比色，记录吸光值；

6. 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释液总体积（20μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：μg/μL）。 B． 分光光度计测定

1. 标准曲线的绘制：各管按照下表加入试剂

孔号 0 1 2 3 4 5 6 7 蛋白标准溶液0 5 10 20 40 60 80 100 （μL） 去离子水（μL） 100 95 90 80 60 40 20 0 对应蛋白含量0 2.5 5.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 （μg） 2. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀； 3. 各管加入1000μL BCA工作液；

4. 各管充分混匀，37℃放置30分钟，然后在562nm下比色测定。以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线； 5. 稀释待测样品至合适浓度，样品稀释液总体积为100μL，加入BCA工作液1000μL，充分混匀，37℃放置30分钟后，以标准曲线0号管做参比，在562nm波长下比色，记录吸光值；

6. 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释液总体积（100μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：μg/μL）。 A-4 电泳上样样品的准备

A-4-1 变性、还原蛋白样本

一般的抗体只能识别抗原蛋白中的部份序列结构（表位），因此，为使抗体能够达到结合该表位而需要将蛋白样本进行变性，使之打开折叠的空间结构，

蛋白变性一般使用含阳离子变性去污剂如SDS的上样buffer （loading buffer），并于95-100°C 煮沸 5分钟，对于多次跨膜蛋白，可以于70°C 加热 5-10分钟，标准的上样buffer称为2X Laemmli buffer，上样时与样本！：！混合后变性上样即可： 2X Laemmli buffer 4% SDS

10% 2-mercaptoethanol 20% glycerol

0.004% bromophenol blue 0.125 M Tris HCl

Check the pH and bring it to pH 6.8.

SDS的阴离子环绕蛋白肽键使之带负电荷，蛋白分子量不同，结合的SDS数量不同，所带负电荷也不同，电泳迁移速度不同，因此SDS-PAGE电泳可将不同分子量的蛋白分离开。

A-4-2天然和非还原样本