western blot原理，操作 - 图文

蛋白免疫印迹杂交（Western Blot）技术手册

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蛋白免疫印迹杂交（Western Blot）技术手册

蛋白免疫印迹杂交（Western Blot WB）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。本指南讨论Western Blot操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。

A 蛋白样本提取制备 1 细胞或组织裂解 2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 3 蛋白定量

4 电泳上样样品的准备 B 电泳

1 PAGE胶的制备 2 蛋白分子量Marker 3 阳性对照 4 内参对照 5 上样与电泳

C 转膜与显色（Western Blot）

1 胶中蛋白的检测 2 蛋白转膜

3 膜上蛋白的检测：丽春红 4 膜的封闭 5 一抗的孵育 6 二抗的孵育 7 显色

D 常见问题分析与解决方案

附录1 WB实验试剂配制方法 附录2 SDS-PAGE胶的配制

WB概述: 检测原

理:

A 蛋白样本提取制备

蛋白样品制备是Western Blotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤，

总体原则和注意事项：

1：尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白 （通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）

2：保持蛋白的处于溶解状态（通过裂解液的PH 盐浓度 表面活性剂、还原剂等的选择）

3：提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）

4：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）

5：样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。

A-1 细胞或组织裂解 A-1-1 细胞裂解

裂解液Lysis buffer或商品化蛋白抽提试剂盒的选择* 目的蛋白分布定位 推荐裂解液Lysis buffe 推荐试剂盒 全细胞 NP-40 or RIPA（附录1） 全蛋白抽提试剂盒 细胞质（可溶蛋白） Tris-HCl（附录1） 胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒 线粒体蛋白提取试剂盒 细胞质（细胞骨架等不Tris-Triton（附录1） 蛋白分级抽提试剂盒 溶蛋白） 细胞质（磷酸化蛋白） 磷酸化蛋白抽提试剂盒 细胞膜 NP-40 or RIPA（附录1） 膜蛋白抽提试剂盒 蛋白分级抽提试剂盒 核蛋白抽提试剂盒 线粒体蛋白抽提试剂盒 亚细胞定位蛋白抽提试剂盒 细胞裂解操作方法：

1 培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（种类与量见本节2）

2 吸净PBS，加入预冷的裂解液，（(1 ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask; 0.5ml per 5x106 cells/60mm dish/75cm2 flask).

3 用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中，

细胞核 线粒体 RIPA（附录1） RIPA（附录1）