western blot原理，操作 - 图文(3)

某些抗体识别的表位是非连续氨基酸构成的蛋白三维结构，此种情况则需要进行非变性的WB，抗体的说明书一般会标注，这种非变性电泳不加SDS，样本也不需煮沸。

某些抗体仅识别蛋白的非还原态，如某些cysteine基的氧化态，因此loading buffer和电泳液中不加入?-mercaptoethanol and DTT 蛋白状态 还原—变性 凝胶状态 还原和变性 loading buffer 有 ?-mercaptoethanol 或DTT 和SDS 还原和非变性 有?-mercaptoethanol 或DTT ，无SDS 非还原和变性 无?-mercaptoethanol 或DTT ，有SDS 非还原和天然 无?-mercaptoethanol 或DTT ，无SDS 电泳缓冲液 有SDS 还原—天然 无SDS 氧化-变性 有SDS 氧化-还原 无SDS 注：除说明书特别标注之外，一般情况下，均使用变性和还原电泳 B 电泳

B-1 PAGE胶的制备

聚丙酰胺凝胶PAGE电泳根椐蛋白分子量进行分离蛋白，PAGE胶是由两种化合物聚合而成的，即丙烯酰胺（acr）和N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis).，聚合需加入过硫酸铵及DMAP 或 TEMED，凝胶为中性、水溶性、三维网状结构。凝胶的孔径取决于总丙烯酰胺的百分含量（%T)）和交联度（%C），T%=(a+b)/m*100%; 和 C%=a/(a+b)*100%,其中: a=双体(bis)的重量 ;b=单体(arc)的重量 ;m=溶液的体积(ml) 。丙烯酰胺总量增加，则孔径减小，5%C构成最小的孔径，任何的 %C增加或降低，孔径都增加，凝胶的百分浓度组成需两个参数，丙烯酰胺（acr）和N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis).的总量百分浓度（w/v）。

不同分子量的蛋白选择不同的凝胶浓度（参考下表》，原则上高分子量蛋白用低浓度胶，低分子量蛋白用高浓度胶分离。 蛋白分子量 (kDa) 4-40 12-45 10-70 15-100 25-200 凝胶浓度 (%) 20 15 12.5 10 8 不同浓度的凝胶的配制方法见附录2 首先配制各组分贮备液，然后分别配制浓缩胶和分离胶。

B-2 蛋白分子量Marker

预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪

商业化产品：

非预染Marker (MW 116, 97.4, 66, 45, 36 29, 24, 20.1, 14.2KDa) 预染Marke r (MW 116, 97.4, 66, 45, 36 29, 24, 20.1, 14.2KDa)

B- 3 阳性对照

目的蛋白或明确表达目的蛋白的组织或细胞的蛋白提取物，用于检验整个实验体系和过程的正确性有效性/特别是一抗的质量和效率。建议使用该对照。可查阅文献或抗体说明书选择购买或自提该对照样本。 B-4 内参对照

管家基因编码的、很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白，用于检测整个WB实验过程及体系是否正常工作，并作为半定量检测目的蛋白表达量的标准对照。必须设立。

内参Beta-actin 抗体 at 1/5000 dilution, Lysates/proteins at 20 ug per lane Lane 1 : HeLa nuclear Lane 2 : HeLa whole cell lysate Lane 3 : A431 cell lysate Lane 4 : Jurkat cell lysate Lane 5 : HEK293 cell lysate.

B-5 上样与电泳

每孔上样量为20-40 μg蛋白，使用专用枪头或注射针头，勿溢出加样孔，

标准电泳缓冲液：1X Tris-glycine： 25 mM Tris base 190 mM glycine 0.1% SDS 调 pH;8.3.

电泳时间按电流仪说明书推荐方法使用,(1小时或过夜，取决于电压大小），当染料到达胶的底部，关电源停止电泳，胶不能存放，应立刻进行下一步的转膜。

C 转膜与显色（Western Blot） C-1 胶中蛋白的检测

电泳后检测蛋白是否迁移正确与平均，可采用铜染或考马斯蓝染色检测，如果凝胶中的蛋白需要进行转膜则需可逆的铜染法，否则采用不可逆考马斯蓝法染色。

铜染法：电泳胶用蒸馏水洗数秒钟，加入0.3 M CuCl2染色5-10分钟，再用去离子水洗一次，在暗背景下观察在兰色胶背景下蛋白出现透明条带，胶置于0.1- 0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0缓冲液中漂洗脱色两次，再置于电转缓冲液中开始转膜。

考马斯蓝法：用40%双蒸水, 10% 醋酸, 50%甲醇的溶液固定胶中蛋白，考马斯蓝R-250染液（凯基产品）室温染色4小时至过夜，保持摇匀，转入67.5%双蒸水, 7.5% 醋酸, 25%甲醇l摇匀至脱去多余的染料，蛋白被染成深蓝色。

C-2 蛋白转膜

蛋白因结合SDS而带电荷，在电场下从胶中转至膜上，转膜操作根椐电转仪制造商的说明书进行转膜方式分为半干和湿转两种，半干式转膜速度快，而湿式成功率高并特别适合用于分子量大于100KD的蛋白。 湿式转膜三明治排列为：海绵/纸/胶/膜/纸/海绵，全部紧密排列，特别是胶/膜之间不能留有气泡，三明治安放的方向确认正确负极方为带负电的胶里的蛋白，向正极方（膜）电迁移。

标准的电转缓冲液为1X Tris-glycine buffer 不含SDS，但加入20%甲醇，如果转膜的蛋白分子量大于80KD，则推荐加入SDS使之终浓度为0。1%。

半干式转膜中，三明治的排列为：/纸/胶/膜/纸，用电转缓冲液浸湿后，直接置于电转仪的正负极之间。胶于负极而膜置于正极。半干式的电转缓冲液可不同于湿式的电转缓冲液，推荐为：48 mM Tris, 39 mM glycine, 0.04% SDS, 20%甲醇，