western blot原理，操作 - 图文(4)

两类膜可供选择：硝酸纤维素膜和PVDF膜（正电荷尼龙膜），根据不同需要选择（下表），PVDF膜需要浸泡甲醇中1-2分钟，再孵育于冰冷的电转缓冲液中5分钟，胶也需在冰冷的电转缓冲液中平衡3-5分钟，否则转膜时会导致条带变形。

注：大蛋白和小蛋白的转膜

电转移缓冲液中SDS与甲醇的平衡、蛋白的大小、胶的浓度都会影响转膜效果，如下调整可以增加转膜效率： 大蛋白（大于100 KD）

1．对于大蛋白而言，其在凝胶电泳分离迁移较慢，而从凝胶转出也非常慢，因此对于这种大分子量蛋白应该用低浓度的凝胶，8%或更低，但因低浓度的胶非常易碎，所以操作时需十分小心，

2 大蛋白易在凝胶里形成聚集沉淀，因此转膜时在电转移缓冲液加入终浓度为0.1%的SDS，以避免出现这种情况，甲醇易使SDS从蛋白上脱失，因此应降低电转移缓冲液中甲醇的浓度至10%或更低，以防止蛋白沉淀。

3 降低电转移缓冲液中甲醇的比例以促进凝胶的膨胀，易于大蛋白的转出。

4 如果使用硝酸纤维素膜，甲醇是必需的，但如果是PVDF膜，甲醇可以不必加入电转移缓冲液中，但转膜前PVDF需用甲醇活化。 5 选择湿式，4℃转膜过夜，以取代半干式转膜。

小蛋白（小于100 KD

1 SDS妨碍蛋白与膜的结合，特别是对小蛋白更是如此，因此，对于小分子的蛋白，电转移缓冲液中可以不加SDS。 2 保持20%的甲醇浓度

对于大于500KD的蛋白，请参考下述文献：Bolt and Mahoney, High-efficiency blotting of proteins of diverse sizes following sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide, gel electrophoresis. Analytical Biochemistry 247, 185–192 (1997).

更多的转膜注意事项：

? 避免用直接接触膜，应使用镊子，手指上的油脂与蛋白会封闭转膜效率并易产生背景污斑

? 排列三明治时，尽量用移液器或15ml试管赶除胶与膜之间的气泡，或将三明治放在装有的培养皿中以防止气泡产生，请戴手套！ ? 确认裁剪的膜和滤纸与凝胶尺寸相同，否刚导致电流不能通过膜，从而转膜无效

? 鸡抗体易于与PVDF膜和其它尼龙膜结合，导致高背景，请替换成硝酸纤维素膜以降低背景。

C-3 膜上蛋白的检测：丽春红

为检测转膜是否成功，可用丽春红染色，

2%的丽春红贮备液(20ML)：: 2%丽春红(0.4克)溶于30%三氯乙酸(6克)和30%磺基水杨酸(6克)

丽春红染色工作液：2%的丽春红贮备液1：10稀释，即加9 倍的ddH2O 染色方法：

将膜放入TBST洗一次，再置于丽春红染色工作液中,在室温下摇动染色5分钟，大量的水洗膜直至水变清无色蛋白条带清晰，（膜也可以用TBST或水重新洗后再进行染色）PVDF膜需用甲醇再活化后用TBST洗后进行封闭。

10x TBS的配制 24.23 g Trizma HCl 80.06 g NaCl 加约 800 ml 超纯水 用纯HCl调pH 至7.6 定容至 1 L. TBST的配制

配制 1 L TBST：: 量取100 ml 10x TBS + 900超纯水 + 1ml Tween20 Tween20非常粘稠，用枪头不易吸取，请确定加入准确的量，最好用Tris buffer.配成10%的Tween20母液后使用。

C-4 膜的封闭

为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景，因此需要进行膜的封闭，

传统上有两种封闭液：脱脂奶粉或BSA，脱脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白（因脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白），使用脱脂奶粉会结合磷酸化抗体从而易产生高背景。

某些抗体用BSA封闭时因不明原因可能会产生比脱脂奶粉更强的信号，，请仔细阅读说明书注明的注意事项和膜的特殊的封闭方法。

配制5%脱脂奶粉或 BSA 溶液：每100 ml TBST中加入5 g脱脂奶粉或 BSA，混匀后过滤，如不过滤会导致使膜污染上细微黑颗粒。

封闭时，4°C摇动，封闭1 hour ，再用TBST洗5秒，进入下一步抗体的孵育。

C-5 一抗的孵育

孵育Buffer：按抗体说明书建议的稀释倍数，用TBST稀释一抗，如果说明书没有建议的稀释倍数，则参照一般推荐的稀释倍数(1:100-1:3000)，一抗浓度过高会导致产生非特异性条带。

某些实验室传统上在封闭液中孵育抗体，而有些实验室用不含封闭剂的TBST来孵育抗体，结果因抗体而异，有时两者结果相同，有时结果不同。 注：如果不存在高背景的问题，某些抗体用含低浓度(0.5 – 0.25%) 脱脂奶粉或 BSA的封闭液来,稀释，可产生相对更强的信号条带。 孵育时间：一抗的孵育时间可从几小时至过夜（一般不超过18小时）不等，取决于抗体与蛋白的亲和性和蛋白的含量丰度，建议使用较高的抗体稀释倍数和较长的孵育时间来保证特异性结合。

孵育温度：尽可能低温孵育，如果在封闭液中孵育一抗过夜，应在4oC进行否则会产生污染而破坏蛋白（降别是磷酸基团）。

孵育一抗时需保持适当的摇动使之均匀覆没膜，防止结合不均匀。

C-6 二抗的孵育

一抗孵育结束后，用TBST摇动洗膜数次，每次5min或更长，去除残留的一抗。

孵育Buffer和稀释倍数：用TBST按说明书推荐的倍数稀释二抗，如果说明书没有标出稀释倍数，则按常规的倍数稀释(1:1000- 1:20,000)预试，二抗的浓度过高也会导致非特异性条带。亦可以在封闭液中孵育二抗（和一抗），但可能在降低背景同时导致特异性条带的信号也减弱，可能是封闭剂阻碍了抗体与靶蛋白的结合。 孵育时间和温度：室温、1-2 hours, 摇动

二抗连接物：推荐使用二抗连接HRP，不建议连接AP碱性磷酸酶，因其不够灵敏。 C-7显色

显色分为酶促底物发光和化学发光法或荧光法

酶促底物发光法代表为DAB显色法，与其它同类方法的比较如下图所示：

而现在最常用的是化学发光法：HRP化学发光底物 Luminol（ECL法 chemiluminescence）及其改良法，

对于 HRP偶联的二抗，一般传统上使用ECL 和ECL+，推荐使用后者，更灵敏。其中不同商家的产品特点总结如下表：