碱裂解法提取质粒DNA和质粒DNA的纯化

实验一、碱裂解法提取质粒DNA和质粒DNA的纯化

一、实验目的

学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法和进一步的纯化技术。

二、实验原理

在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA又恢复到原来的够型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶物，通过离心沉淀可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂的RNA可用RNaseA酶消除，再用酚/氯仿处理，可除去残留的蛋白质，达到纯化质粒DNA的目的。

三、实验材料

大肠杆菌DH5α（含重组了约800bp DNA片断的pMD18-T质粒，Amp抗性）

四、实验仪器、用具

高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、台式离心机、涡旋振动器、培养管、移液器、离心管、吸管头、量筒、紫外观测仪

五、实验试剂

LB培养基、3mol/L醋酸钠（pH5.2）、TE缓冲液（pH8.0）、无水乙醇、75%乙醇、RNaseA（10mg/ml）、goldview DNA染色剂、氯仿、琼脂糖 抽提质粒DNA所需的溶液：

溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），10 mmol/L EDTA (pH8.0)；

溶液Ⅱ： 0.2 mol/L NaOH， 1%SDS(w/v)，现配现用；

溶液Ⅲ：3 mol/L KAc，用冰醋酸调pH值至5.2；

电泳缓冲液（0.5×TBE）：45 mmol/L Tris-硼酸，1 mmol/L EDTA，pH8.0；

六、实验步骤：

1、质粒DNA的提取

（1） 在LB固体平板上挑单菌落接入2ml 含Amp的LB液体培养基中（已

灭菌），37℃振摇培养过夜；（已经完成）

（2） 取1mL菌液放入Ep管中，12000 r/min（简写rpm）离心1min；弃尽

上清；

（3） 加入200μL预冷的含RNaseA的溶液I，旋涡混匀；

（4） 加入200μL的溶液Ⅱ，温和混匀，室温静置5min以充分裂解细菌；

（5） 加入200μL的溶液Ⅲ，温和混匀，－20℃放置8min；

（6） 12000rpm离心5min；

（7） 吸上清至另一新的1.5mL EP管，加500μL氯仿/异戊醇（V：V=24：

1）充分混匀，12000rpm离心5min；

（8） 小心移取上清液500μL至另一新的1.5mL EP管，加入2倍体积无水

乙醇，充分混匀，-20℃静置10min，12000 rpm离心10min，弃上清；（静置期间安排制琼脂糖凝胶，每组制胶一块，具体见附件）

（9） 加入200μL70%乙醇洗DNA沉淀，12000rpm离心5min，倒掉乙醇，

再12000rpm离心几秒钟，用移液器尽可能除去乙醇，烘箱适度风干；

（10）加入20μL RTE （含10μg/mL RNaseA 的TE，pH8.0）溶解质粒DNA，

37℃放置10min。

（11）取4～5μL质粒DNA溶液于另一干净离心管中，加入8μL TE及2μL

（12）打开电源开关，调电压为80~100伏进行电泳 (注意电泳方向！！！)。

（13）电泳约40分钟后关掉电源，把凝胶置于紫外仪上观察结果并记录。

七、结果与分析

根据实验得出的结果，分析并有关影响因素和实验过程中的注意事项。

附：1％琼脂糖凝胶的制作

以制30mL量的琼脂糖凝胶为例，具体过程如下：

1、称量0.3g的琼脂糖粉置于一干净的小三角瓶中；

2、加入30mL 0.5×TBE于三角瓶中，称出总重量并记录；

3、在微波炉中充分溶解（约1分钟），称溶解后的总重量并用蒸馏水补充至原总重量（注意不要烫到手！！）；

4、室温条件下放置或自来水冲三角瓶下部到溶液温度冷却到约50度，此时再加入1.5μL goldview染料(原则上按照100mL琼脂糖液加goldview染料3-5μL)，混匀；

5、把混合液倒入一已插入梳子的制胶模具中，让其自然充分凝固（一般需要20分钟以上）；

6、小心拔掉梳子，把凝胶连同胶膜一起转移到电泳槽中（TBE缓冲液的添加以没过胶面1～2毫米为宜），即可用于点样和电泳检测。

注意：实验报告要求手写，报告在一周内完成上交，不收打印的报告。