利用细胞计数手段和DGGE技术分析松花江干流部分地区的细菌种群多(2)

来源：网络收集时间：2026-09-13

导读： USA）进行提� Ｌ崛∏敖仓靡欢问奔洌顾鵇NA采用DNeasyBlood和TissueKit（QIAGEN， DNA提纯后重悬体中的沙砾等悬浮颗粒沉淀下来，取上层清液1．5mL按照试剂盒提供步骤进行DNA提取，于200μLTE缓冲液。泥

USA）进行提取。提取前将水样静置一段时间，使水水样DNA采用DNeasyBlood和TissueKit（QIAGEN，

DNA提纯后重悬体中的沙砾等悬浮颗粒沉淀下来，取上层清液1．5mL按照试剂盒提供步骤进行DNA提取，于200μLTE缓冲液。泥样DNA采用淤泥基因组DNA快速提取试剂盒（离心柱型）进行提取，取样量为

（0.25±0．005）g，DNA提纯后重悬于50μLTE缓冲液。提取的DNA样品均置于－20℃保存备用。1．5

巢式PCR扩增

（1）根据NicoBoon等人［9］的实验结果，DNA含量较低的样品中富集目巢式PCR有利于从微生物较少、的基因；本研究采用这一手段，从松花江水样直接提取的DNA样品中富集目标DNA片段。巢式PCR扩增引CAGGCCTAACACATGCAAGTC）和1378r（5'-物为16SrDNAV3区的通用引物。第一步反应引物为63F（5'-CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG）；第二步反应引物为338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和518r（5'-GC链结构为5'-ATTACCGCGGCTGCTGG）。为后续DGGE准备，引物338f需在其5'末端加上GC链，

［4］CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG。扩增产物片段长236bp。上述引物由生工生

［8］

物工程（上海）有限公司合成。

（2）巢式PCR反应体系，Mg2+终浓度为第一步反应体系为25μL，包括5μL10×PCR缓冲液（10mmol/L，1．5mmol/L），0．5μLdNTP（10mmol/L），0．25μLTaq酶（5u/μL），各0．5μLPCR前、后引物（10umol/L），17．25μLddH20和1μLDNA模板。第二步反应体系为50μL，体系中各组分由第一步反应的组分加倍，其中DNA模板由第一步PCR产物适当稀释而来。

（3）PCR反应程序为降落PCR（TouchDownPCR）。参考NiannianJi等人的程序［10］，改良程序如下：预变65—55℃1min，72℃1min；后20个循环为：94℃1min55℃性条件为94℃5min；前10个循环为：94℃1min，1min，72℃1min；72℃延伸7min。1．6

变性梯度凝胶电泳分析

Rad公司的DcodeUniversalMutationDetectionSystem电泳系统进行变性梯度凝胶电泳。本使用美国Bio-

3508生态学报32卷

研究使用的是浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺=37．5∶1），选用的变性剂梯度为30%—60%［100%的变性剂中含有7mol/L的尿素和40%的去离子甲酰胺］，用1×TAE将两种变性梯度的溶液配至16mL，灌胶量为14．5mL。待胶凝固后，将20μL的PCR扩增产物和5μL溴酚蓝染料混合均匀，上样量为25μL。

YongLi等人［11］的做法，运行条件参考Zhi-根据PCR产物略作调整，具体如下：将上样后的胶板置于1×40mmol/LTris，40mmol/L冰乙酸，1．0mmol/LEDTA（pH值8．0）］TAE［电泳缓冲液中，恒温60°C，恒压140V跑4h。电泳完毕后，用ddH2O漂洗凝胶，再用0．5μg/mLEB染料染色30min，在ImageQuant350（GEhealth）成相系统下进行拍照并分析。1．7

数据分析

本课题选用的DGGE图谱分析软件为BioRad公司的凝胶定量软件QuantityOne。在图像处理过程中，首先排除干扰的背景后，经过泳道识别、条带识别和配对3个步骤，对图谱中的条带进行定量对图谱进行优化处理，

分析。根据定量结果，进一步得到泳道间的对比分析结果，主要包括泳道对比图、系统进化树和相似性矩阵图。

利用QuantityOne软件输出的DGGE图谱数据可计算各采样点的多样性指数、丰度及均匀度。其中，微生物群落的多样性指数其计算公式如下：

i=s

［12］

WienerIndex指数，指的是Shanno-一般用于比较各样品的细菌多样新，用H表示，

NiNi

ln）NN

H=－

∑（PilnPi）=－

i=1

∑（

i=1

Pi是某个样品中单一条带强度在该样的所有条带总强度所占的比率，s是某个样品中所有条带数目总式中，

N为泳道中所有条带的光密度和，Ni为第i个条带的光密度值。丰度（S）为DGGE胶中每个泳道的条带和，

数。均匀度（EH）为：

EH=

22．1

结果

松花江水域总微生物数量分析

流式细胞技术是利用流式细胞仪测量液相中悬浮在国内被广泛单细胞或微粒信号的一种现代分析技术，应用于医学、发酵和环保领域

［14］

HH［13］

=HmaxlnS

；但在细胞计数，尤其

是水生态方面的应用并不是十分广泛。

本课题利用流式细胞仪对松花江的总微生物浓度图2显示了该地区的总进行了检测。以呼兰河口为例，微生物数量。

流式细胞仪检测结果显示，各地区水样总微生物数

量的数量级在10左右，最高点出现在桦川段，其数值

为11．610×10；最低点出现在佳木斯段，其数值为

1.121×106。各地数值的连续性并不是很理想，在佳木斯、通河渡口地区的水生微生物总细胞数均与前后地区的总细胞数相差较大。2．2

平板培养细胞数与总细胞数的比较

表1所示为松花江干流部分自下游到上游的15个采样点所得数据。其中，总细胞数由流式细胞仪测得，可培养细菌数为平板培养方法测得，两种方法均设置3次平行试验并取平均值。15支水样中，总细胞数的数

图2呼兰河口水样总微生物计数FCM示意图

Fig．2FCMdot-plotfortotalbacterialconcentrationinwater

samplefromHulanRiverestuary

图中横坐标FITC（Fluoresceinisothiocyanate，异硫氰酸荧光素）表明使用的染料，纵坐标SSC（Sidelightscatter，侧向角散射）产生的散射光信号提供有关细胞颗粒性质的信息；右下部分的密集点群为经SYBRGreenI染色显示出的微生物细胞颗粒

11期

屠腾等：利用细胞计数手段和DGGE技术分析松花江干流部分地区的细菌种群多样性

3509

量级在10左右，而平板培养细胞数仅为10左右，在总细胞数中所占比例为0．05%至5%，平均比例不超过2%。这一结果表明，传统的平板培养测数方法容易低估水环境中实际的微生物数量。在连续性方面，流式计数法给出的总细胞数在某几点上不是很连续，在总体看来还是有一定的变化规律；而平板培养细胞数则较为其各点前后相差数目均比较明显，不具有连续性。缺乏规律性，

表1

Table1

松花江干流部分地区水样平板培养微生物计数

HPCandtotalbacterialconcentrationindifferentwatersamplesfrommainstreamoftheSonghuaRiver

总细胞数（×106）

Totalcells

4．6404．5807．65011．6001．1206．3606．6306．5906．2003．9904．7602．3004．4009．3003．080

可培养细胞数（×104）

Cultivablecells

18．6000．66710．8000．5876．3304．87015．9004．5705．10011．8004．47010．6000．7134．00011．400

可培养细胞所占百分比

Percentage（Cultivablecells/Totalcells）

4．02%0．15%1．41%0．05%5．65%0．77%2．40%0．69%0．82%2．97%0．94%4．61%0．16%0．43%3．70%

取水地点

Watersamplingspots同江三江口富锦桦川佳木斯哈尔滨四方台东江桥阿什河口呼兰河口大顶子山倭肯河宏克力通河渡口依兰

Allen［15］提出，平板计数法，不管其具体方法如何，都无法完全表达出水样中真正的微生物含量。在Kell［16］等人看来，平板计数方法可能会忽略水环境中具有生理特性表达但是无法培养成为肉眼可见的群落的因此，这一方法所得的细菌数量将大大少于实际的有效值，降低了平板培养方法的有效性和可信度。细胞，

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