利用细胞计数手段和DGGE技术分析松花江干流部分地区的细菌种群多

第32卷第11期2012年6月

DOI：10．5846/stxb201105160635

生态学报ACTAECOLOGICASINICA

Vol．32，No．11Jun．，2012

2012，32（11）：3505-3515．屠腾，李蕾，毛冠男，王莹莹．利用细胞计数手段和DGGE技术分析松花江干流部分地区的细菌种群多样性．生态学报，

TuT，LiL，MaoGN，WangYY．AnalysisofbacterialdiversityintheSonghuaRiverbasedonnestedPCRandDGGE．ActaEcologicaSinica，2012，32（11）：3505-3515．

利用细胞计数手段和DGGE技术分析松花江

干流部分地区的细菌种群多样性

屠

腾，李

蕾，毛冠男，王莹莹

*

（南开大学环境科学与工程学院，环境污染过程与基准教育部重点实验室，天津300071）

摘要：松花江是我国东北地区的重要河流之一，为加强对其水环境微生物状况的了解，对松花江干流部分地区的微生物数量和多样性进行了分析。应用传统平板培养法和流式细胞技术测定水样中的细菌数；直接提取样品中的总DNA，以巢式PCR（PolymeraseChainReaction）扩增细菌16SrDNA片段，应用聚丙烯酰胺凝胶电泳（DenaturingGradientGelElectrophoresis，DGGE）pH值为影响水环境中微生物总细胞数量技术对扩增片段进行分离，研究水样和底泥样品细菌的种群多样性。实验结果显示，的主要因素。水样中细菌群落多样性主要根据上下游分区，分区点在哈尔滨段附近，而底泥中细菌群落多样性的影响因素呈多没有显示出较为明确的分区特征。样化，

关键词：松花江；流式细胞术；巢式PCR；DGGE；细菌群落多样性

AnalysisofbacterialdiversityintheSonghuaRiverbasedonnestedPCR

andDGGE

TUTeng，LILei，MAOGuannan，WANGYingying*

KeyLaboratoryofPollutionProcessesandEnvironmentalCriteriaMinistryofEducation，CollegeofEnvironmentalScienceandEngineering，NanKaiUniversity，Tianjin300071，China

Abstract：AsthelargesttributaryoftheHeilongRiver，theSonghuaRiverflowsabout1，434kilometersfromtheChangbaiMountainsthroughtheJilinandHeilongjiangprovinces．ItoccupiesasignificantpositionintheecologicalandcommercialfieldsinNortheastChina．Asitsuffersfromcomplexcontaminantconditions，comprehensiveenvironmentalimprovementandmanagementoftheSonghuaRiverisvital．Thus，arelativelyaccuratemonitoringandinvestmentsystemisessentialtosupplybasicdatafordecisionandpolicymaking．Inthisstudy，weaimtoanalyzethebacterialconcentrationanddiversity，alongwiththeirrelationshiptovariousenvironmentalfactorsintheriver，forthepurposeofabriefevaluationtowardsthemicrobialconditionintheSonghuaRiver．RepresentativesamplingpointswerechosenfromupstreamtodownstreamoftheSonghuaRiver．Atotaloffifteenwatersamplesandtensludgesampleswerecollected．Thebacterialconcentrationwasassessedbybothtraditionalheterotrophicplatecounts（HPC）andanovelflowcytometric（FCM）technique．HPCusedtobewidelyutilizedasanapproachtodetectthecultivablebacterialcommunities；however，ithasbeenunderdiscussionduetoitsnon-negligibledrawbacksandthedevelopmentofnewalternativetools．ResultsshowthattheorderofmagnitudeofcultivablecellscountedbyHPCisabout106whiletheorderofmagnitudeoftotalcellscountedbyflowcytometryisabout104．Itshowsthattraditionalheterotrophicplantcountsmighteasilyneglectthosecellsthatareuncultivablebutpossessphysiologicalproperties．Also，flowcytometryexhibitsseveraladvantagescomparedwithHPC，forinstance，morerapid

基金项目：国家水专项（2008ZX07526-002-01）；国家自然科学基金项目（31000247）收稿日期：2011-05-16；

修订日期：2012-03-13

*通讯作者Correspondingauthor．E-mail：wangyy@nankai．edu．cn

ratesandgreatersensitivity．Regressionanalysisofenvironmentalfactorsandmicroorganismconcentrationswasmadebasedonfourmainfactors：temperature，pH，dissolvedoxygen，andconductivity．ResultsshowthatpHhasthemostsignificanteffecttowardsthetotalcellcountineachsample．Themoleculartechniqueusing16SrRNAprofilesgeneratedbyPCR-DGGEwasusedinordertodeterminethevariationinbacterialcommunitystructureofwaterandsludgesamplesfromtheSonghuaRiver．NestedPCRandtouchdownPCRwereutilizedforthepurposeofgeneratingmoreDNAfromsamples，especiallyaquaticsamples．Similarityanalysis，clusteranalysisandstatisticalanalysiswereperformedaccordingtotheDGGEgelsandthedataoutputbyQuantityOne．TheresultsshowedthatthebacterialdiversityinwatersampleshasanandthedemarcationpointisneartheareaofHarbincity．However，obviousdiscriminationbetweenupperandlowerzones，

bacterialdiversityinthesludgesamplesshowednosignificantdifferencesalongtheriverbasin．TheShanno-WienerIndex，UniformityIndexandrichnessofwaterandsludgesampleswerecalculatedaccordingtotheDGGEprofiles．Theresultsshowedthatthebacterialdiversityandrichnessdecreasesfromdownstreamtoupstream．Thepresentstudyprovidesfundamentaldataforbacterialconcentrationanddiversity，togetherwithinfluencingenvironmentalfactors，whichcouldbeusedtosupportthefuturediscriminationbetweenfunctionalzonesinthewholeSonghuaRiverBasin．KeyWords：SonghuaRiver；FCM；nested-PCR；DGGE；Bacterialdiversity

2

松花江是黑龙江水系在我国境内的最大支流，全长1956km，流域面积达54．56万km，为我国东北部地

干流长，支流众多，流域面积广，污染情况较为复杂，工业污区最为重要的水上运输线之一。松花江水系发达，染和城市污染是其流域内污染的主要因素

［1］

。其次，松花江流域的生态环境一直承受着城市经济发展的压

［2］

自我恢复能力受到限制，造成土地沙化、水源涵养能力下降和水土流失严重；大量泥沙夹带有机质进入河力，

流，引起松花江干流有机质浓度增高和细菌的大量繁殖

。2005，受中国石油吉林石化公司爆炸事故影响，

［3］

松花江受到苯系物（苯、苯胺、硝基苯、二甲苯等）的污染，水质发生恶化，并将持续相当长的一段时间。新老污染导致的环境复杂性和流域面积广阔带来的水质数据不足，成为松花江监测和治理的障碍。为了弥补水环境数据的缺失，本研究从松花江微生物数量、群落多样性角度出发，分析松花江的水质状况和发展趋势，旨在分区、管理和治污提供一定程度的理论支持。为其进行监测、

关于微生物的数量和群落结构的研究，传统方法一般是对细菌进行分离、培养和鉴定，但这种方法具有无法避免的缺陷。Amann等人

［4］

——中营养湖泊中的研究发现，自然界中大部分的微生物无法通过培养鉴别—

可培养细胞占细胞总数的0．1%至1%，未受污染的河口水中可培养细胞也只占0．1%至3%，这意味着传统的培养方法推算出的水体微生物数量并不十分准确。本研究为了解决这一问题，采用了新型的流式细胞计数并通过与 …… 此处隐藏：4140字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……